高磷诱导下肢血管平滑肌细胞成骨分化关键差异表达基因筛选及验证

目的:采用mRNA高通量测序技术筛选高磷诱导下肢血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化差异表达基因(DEGs),分析VSMCs钙化的关键基因及信号通路。方法:将人VSMCs分为对照组和模型组,模型组细胞中加入高磷培养基,对照组细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基于相同条件下培养。调整2组稳定转染VSMCs的状态,培养12 d,倒置显微镜下观察细胞形态表现并拍照。采用Hisat2软件筛选DEGs,采用Stringtie软件从生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)3个方面进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。Von Kossa染色法观察各组细胞钙化情况,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组细胞中碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肿瘤蛋白53(Tp53)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白轻链1(Ftl1)和糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(GPLD1)mRNA表达水平。结果:与对照组比较,模型组共2 524个DEGs,其中1 368个DEGs表达上调,1 156个DEGs表达下调;2组细胞DEGs聚类分离明显。GO功能和KEGG信号通路富集分析表达上调的DEGs主要参与微管细胞骨架组织的调节、细胞极性、蛋白质定位和细胞周期调控等BP,构建细胞膜部分、微管组织、染色体和着丝粒区等CC,发挥与磷脂酰肌醇磷酸盐、 Rho鸟苷酸三磷酸酶(GTPase)蛋白结合、参与跨膜转运和调节蛋白激酶活性等MF;表达下调的DEGs主要参与细胞质翻译、蛋白质膜定位、mRNA代谢和蛋白质内质网定位等BP,构建核糖体亚单位、细胞膜和自噬体等CC,发挥与单链DNA、核糖核蛋白复合物、生长因子结合、调节蛋白激酶活性和催化作用等MF。差异表达上调的基因富集7条信号通路,其中最为显著的是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的生物合成;差异表达下调的基因富集18条信号通路,其中最为显著的是铁死亡。RT-qPCR法,与对照组比较,模型组细胞中GPX4、Ftl1和Tp53 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),GPLD1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与对照组比较,模型组细胞中α-SMA mRNA表达水平明显降低(P<0.01),ALP和BMP2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论:钙化的VSMCs与正常细胞存在DEGs,铁死亡和GPI锚定的生物合成信号途径是高磷诱导下肢VSMCs钙化的关键信号通路,主要由GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1共同介导完成。

白桦脂酸通过RRAGD/mTOR/ULK1促进自噬改善血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨白桦脂酸(Betulinic acid, BA)对高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的作用机制。方法 采用2.6μmol·g^(-1)高磷诱导小鼠主动脉平滑肌细胞体外钙化模型,CCK8检测白桦脂酸对细胞活力的影响;加入白桦脂酸低、中、高剂量(5μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1))及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5μmol·g^(-1))。慢病毒过表达Ras相关GTP结合蛋白D(Ras-related GTP-binding Protein D,RRAGD)转染血管平滑肌细胞,通过荧光显微镜、RT-PCR验证转染效率。采用茜素红染色、细胞内钙含量、碱性磷酸酶活性检测细胞钙化程度;Western blot检测血管平滑肌细胞钙化指标RUNT相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein, BMP2),平滑肌蛋白22α(Smooth muscle protein 22α,SM22α)和平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA);UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1),自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ),泛素结合蛋白P62(P62),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)以及RRAGD的表达。结果 根据CCK8细胞活力结果选择白桦脂酸5、10、20μmol·L^(-1)剂量进行后续实验;钙水平、碱性磷酸酶活性及茜素红染色实验结果显示白桦脂酸改善高磷诱导血管平滑肌细胞钙化;Western blot结果显示白桦脂酸下调RUNX2、BMP2、RRAGD、p-mTOR、P62(P<0.05),上调SM22α、α-SMA、LC3Ⅱ/Ⅰ、p-ULK1的蛋白表达(P<0.05)。白桦脂酸减轻高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的作用被自噬抑制剂3-MA和过表达RRAGD阻断。结论 白桦脂酸可能通过RRAGD/mTOR/ULK1信号通路促进自噬抑制血管平滑肌细胞钙化。

氯沙坦通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信号通路调节高糖诱导的血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨氯沙坦(LT)通过肌醇需求酶(IRE)1-肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2-凋亡信号调节激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、凋亡和迁移的影响。方法 取对数生长期VSMCs,并分组为空白组、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高糖+LT组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT)、高糖+毒胡萝卜素(TG)组(25 mmol/L葡萄糖+0.2 nmol/L IRE1α激动剂TG)、高糖+LT+TG组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT+0.2 nmol/L TG)。流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell及划痕实验检测细胞迁移;细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测细胞增殖;Western印迹检测IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路相关蛋白表达水平。结果 与空白组相比,高糖组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+LT组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著降低,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),但高糖+TG组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);TG逆转了LT对高糖诱导的VSMCs增殖、凋亡和迁移的作用(P<0.05)。结论 LT可以抑制高糖诱导的VSMCs增殖和迁移,促进其凋亡,可能与抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有关。

TRAF6/Runx2信号轴对牙龈卟啉单胞菌诱导血管平滑肌细胞钙化调控作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)/Runt-相关转录因子-2(Runt-related-transcription factor-2,Runx2)信号轴对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)诱导小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)钙化的调控作用。方法:用热灭活的P.gingivalis和VSMC共培养,在21 d时检测VSMC的钙化沉积和钙含量;并检测VSMC收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α),以及成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)和Ⅰ型胶原A1(type I collagen A1,ColⅠA1)的基因和蛋白表达。此外,检测P.gingivalis诱导VSMC后TRAF6和Runx2的表达,进一步通过抑制TRAF6,检测其对Runx2表达以及VSMC和主动脉的钙化情况的作用。结果:P.gingivalis可促进VSMC发生钙化沉积以及钙含量增加(P<0.05);并且P.gingivalis能显著促进成骨标志物的表达,抑制VSMC收缩标志物表达(P<0.05);当抑制TRAF6表达时,能降低P.gingivalis诱导VMSC中Runx2的表达,并抑制VSMC和主动脉壁的钙化沉积,显著降低VSMC中钙含量(P<0.05)。结论:P.gingivalis促进VSMC成骨标志物表达,抑制收缩标志物表达,最终诱导VSMC发生钙化;并进一步证实P.gingivalis可通过TRAF6/Runx2信号轴调控VSMC和主动脉钙化。

血栓心脉宁片通过调控TGF-β_(1)和Runx2表达抑制血管平滑肌细胞钙化的研究

目的探讨血栓心脉宁片是否可通过调控转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))和Runt相关转录因子2(Runx2)表达抑制血管平滑肌细胞的钙化。方法取对数生长期大鼠血管平滑肌细胞,实验分为5组:阴性组细胞加入DMEM培养液培养;钙化组加入β-磷酸甘油(β-GP)作用24 h诱导血管平滑肌细胞钙化;血栓心脉宁低、中、高剂量组先分别加入125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L的血栓心脉宁片培养24 h后再给予β-GP作用24 h。采用CCK-8法检测各组细胞活力,酶标仪检测各组细胞中钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性及TGF-β_(1)含量,Western blot法检测细胞中Runx2蛋白表达情况。结果与阴性组比较,钙化组细胞活力明显下降(P<0.05),细胞中钙含量、ALP活性、TGF-β_(1)含量及Runx2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与钙化组比较,血栓心脉宁各组细胞活力均明显提高(P均<0.05),细胞中钙含量、ALP活性、TGF-β_(1)含量及Runx2蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且各指标均呈浓度依赖性变化。结论血栓心脉宁片可能通过调控TGF-β_(1)和Runx2的表达,抑制大鼠血管平滑肌细胞的钙化。

LncRNA NORAD通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达。体外分离培养人VSMC,随机分为对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控。结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡。

别嘌醇下调尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞赖安酰氧化酶的表达

目的研究别嘌醇对尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞赖安酰氧化酶(LOX)和磷酸化p-38(P-p38)表达的影响。方法大鼠血管平滑肌细胞分为三组:空白对照组;尿酸组(尿酸40 mg/L干预48 h);别嘌醇组(尿酸40 mg/L及别嘌醇0.3 mmol/L干预48 h)。共聚焦显微镜观察细胞内活性氧情况。提取大鼠血管平滑肌细胞RNA和蛋白,实时荧光定量PCR和Western Blot测定LOX、p-38及P-p38mRNA和蛋白表达。结果尿酸组血管平滑肌细胞增殖量、细胞内活性氧、LOX及P-p38的mRNA和蛋白水平明显高于对照组;别嘌醇组血管平滑肌细胞增殖量、细胞内活性氧、LOX及P-p38的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。结论别嘌醇可抑制尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞LOX和P-p38表达。

冠心宁通过TNFAIP3-ASK1/JNK通路对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转换的调控作用

目的探讨冠心宁(GXN)调控动脉粥样硬化(AS)斑块稳定性的分子机制。方法制备含有GXN药物的血清,利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)构建AS体外模型,Western blot和qPCR检测VSMC表型转换情况。通过沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3),检测GXN对VSMC表型转换的影响。构建凋亡信号调节激酶1(ASK1)过表达载体,并利用Lip3000转染进细胞,检测GXN是否通过凋亡信号调节激酶1/c-Jun氨基末端激酶(ASK1/JNK)通路发挥作用。结果与对照组比较,ox-LDL组的细胞表型转换,表现为I型胶原蛋白(COLIA1和COLIA2)、TNFAIP3和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平降低(均P<0.01),基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13、骨桥蛋白(OPN)、ASK1磷酸化与ASK1比值(p-ASK1/ASK1)、JNK磷酸化与JNK比值(p-JNK/JNK)升高(均P<0.01);GXN处理后VSMC表型转换为收缩型,表现为与ox-LDL组相比COLIA1、COLIA2和α-SMA水平增高(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、TNFAIP3的表达水平、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都降低(均P<0.01)。沉默TNFAIP3后,与ox-LDL+10%GXN+sh-NC组相比,COLIA1、COLIA2、TNFAIP3和α-SMA水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。过表达ASK1后,与ox-LDL+10%GXN+oe-NC组相比,COLIA1、COLIA2和α-SMA的表达水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。结论GXN可能通过TNFAIP3调控ASK1/JNK通路介导VSMC表型转换,从而起到稳定动脉硬化斑块的作用。

红景天苷通过抑制TLR 4/NF-κB通路抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

【目的】本文旨在探讨红景天苷对血管平滑肌细胞钙化的作用及机制。【方法】本研究采用人血管平滑肌细胞钙化模型,用不同浓度的红景天苷处理细胞,茜素红染色及钙离子浓度定量检测细胞钙化,Western blot检测红景天苷对成骨样分化蛋白Runt相关转录因子2(RUNX2)和骨形态发生蛋白2(BMP2)的影响;检测红景天苷对Toll样受体4(TLR4)、核因子κB p65(NF-κB p65)和磷酸化的核因子κB p65(p-NF-κB p65)的影响;检测红景天苷对白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的影响。采用TLR4小干扰RNA(si-TLR4)处理血管平滑肌细胞,研究TLR4介导红景天苷对平滑肌细胞钙化的抑制作用。【结果】茜素红染色及钙离子浓度定量结果提示不同浓度的红景天苷改善高磷诱导的人血管平滑肌细胞的钙化(P<0.05)。与高磷模型组相比,红景天苷(250μmol/L、500μmol/L)下调成骨样分化蛋白RUNX2(P<0.05)和BMP2(P<0.05);250μmol/L、500μmol/L浓度的红景天苷还下调高磷诱导的TLR4(P<0.05)和p-NF-κB p65(P<0.05)的表达,而对NF-κB p65影响无显著差异(P>0.05);红景天苷(250μmol/L、500μmol/L)抑制炎症因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.05)的蛋白水平。此外,茜素红染色及钙定量提示,红景天苷可增强敲低TLR4对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的抑制作用(P<0.05)。【结论】红景天苷可通过抑制TLR4/NF-κB通路抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。

miR-29b通过KLF4调控血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达

目的探讨微小RNA-29b(microRNA-29b,miR-29b)通过靶向作用于Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)信号通路对血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达的影响。方法将血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分为4组:无义序列对照组(control+NC)、miR-29b过表达对照组(control+miR-29b)、无义序列模型组(ox-LDL+NC)、miR-29b过表达模型组(ox-LDL+miR-29b)。对照组细胞正常培养;模型组细胞采用80 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导24 h建立模型。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测VSMCs的增殖情况;实时荧光定量PCR检测miR-29b、单核细胞化学趋化因子1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、MCP-3、α平滑肌肌动蛋白(smooth muscleα-actin,SMα-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM MHC)及KLF4的mRNA表达水平;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测培养上清中MCP-1、MCP-3水平;Western blot检测蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-29b对KLF4的靶向作用。结果ox-LDL刺激VSMCs后,细胞中miR-29b表达量显著下降。与ox-LDL+NC组相比,ox-LDL+miR-29b组细胞增殖减少,炎症因子MCP-1和MCP-3的表达降低,收缩表型蛋白SMα-actin、SM MHC的表达显著升高,KLF4表达下降。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-29b能与KLF4 mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)结合。过表达KLF4可抑制miR-29b的作用。结论miR-29b可靶向作用于KLF4,调控ox-LDL诱导的VSMCs增殖、炎症因子的表达及表型蛋白表达的变化。

miRNA-195在腹主动脉瘤血管平滑肌细胞中作用机制探讨

目的探讨miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤中表达及对血管平滑肌细胞的作用。方法建立大鼠腹主动脉瘤模型,实时荧光定量PCR检测miRNA-195在腹主动脉瘤组织中的表达量;血管平滑肌细胞中转染miRNA抑制物,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测MMP-2、MMP-9和OPN蛋白表达。结果miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤组织中呈高表达;血管平滑肌细胞中转染miRNA-195抑制物后,转染组细胞的增殖能力在48 h、72 h和96 h比对照组提高40.5%(P<0.05)、39.7%(P<0.01)、36.1%(P<0.001),且转染组细胞凋亡率比对照组降低35.6%(P<0.001),MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和OPN蛋白在转染组中表达量分别比对照组降低45.4%、36.8%和48.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-195表达升高导致血管平滑肌细胞数量减少,并可能通过上调MMP-2和MMP-9蛋白表达致细胞外基质发生降解,从而促进腹主动脉瘤的形成和发展。

血管平滑肌细胞表型的成骨转换与血管钙化

血管钙化是血管壁中钙盐沉积的过程,导致血管硬化和失去弹性。它通常发生在中老年人,尤其是患有动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和慢性肾脏疾病等疾病患者。血管钙化是一个主动的过程,其中平滑肌细胞的成骨转换是重要事件之一。这些细胞在钙化过程中释放钙离子,导致钙盐的沉积,形成钙化斑块。血管钙化受多种因素调节,包括高磷、高钙水平及氧化应激、机械应力等。此外,中医药研究在减轻血管钙化方面显示出潜力,例如灵芝孢子粉和其衍生物,三七、黄芩素、根皮素、雷公藤甲素等。这些研究为进一步理解和干预血管钙化提供了重要的证据,并揭示了一些潜在的抑制因子,可以作为未来治疗血管钙化的研究方向。

细颗粒物毒性组分对血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制研究

目的:探究细颗粒物(PM_(2.5))不同组分对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其机制。方法:分别制备PM_(2.5)完全颗粒物、脂溶性组分颗粒物和水溶性组分颗粒物,将VSMCs与PM_(2.5)不同组分染毒液和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂共培养,噻唑蓝比色法(MTT)评价PM_(2.5)不同组分对VSMCs存活的影响;酶联免疫吸附法(ELISA)测定PM_(2.5)不同组分对VSMCs上清液中炎性因子表达的影响;免疫荧光法检测VSMCs中MAPK相关蛋白的表达情况。结果:PM_(2.5)全颗粒(WPPM_(2.5))和脂溶性组分(LSPM_(2.5))对VSMCs存活具有抑制作用,其作用24 h的半数抑制浓度(IC_(50))值分别为178.3μg/ml和283.9μg/ml。LSPM_(2.5)可显著增加白细胞介素-8(IL-8)的表达,U0126、SB2035850和SP600125均能显著降低LSPM_(2.5)增加的IL-8含量,可拮抗WPPM_(2.5)和LSPM_(2.5)对VSMCs的抑制,增加细胞存活率。WPPM_(2.5)和LSPM_(2.5)能激活VSMCs中P38、氨基末端激酶(JNK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路,使其磷酸化蛋白表达增加。结论:PM_(2.5)可通过激活MAPK炎性信号通路抑制VSMCs增殖,该过程主要与其全颗粒和脂溶性组分有关。

衰老血管平滑肌细胞通过力学生物学负调控内皮细胞功能

目的本研究基于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)衰老早于内皮细胞(endo thelial cells,ECs),旨在探究衰老VSMCs对ECs的调控,以深入了解二者之间的互作对相关疾病的贡献。方法免疫印迹检测衰老与年轻血管VSMCs表型标志物表达;体外梯度硬度增加培养板培养ECs后免疫印迹检测功能与表型标志物表达。此外,衰老VSMCs经Flexcell-4000T 10%幅度、1 Hz加载12 h后收取上清,超高速离心获取外泌体并进行力学响应micro RNA(mi RNA)测序与生物信息学分析,筛选出的mi RNAs模拟物处理ECs并进行靶基因预测与免疫印迹验证。结果衰老血管高表达合成型标志物,低表达收缩型标志物;硬度增加导致ECs功能失调、高表达间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(Vimentin);筛选出的上下调力学响应mi RNA:mi R-107-3p、mi R-743b-5p的靶基因预测与验证表明二者可分别靶向程序性细胞死亡分子10(programmed cell death 10,PDCD10)、α-SMA。结论衰老VSMCs可通过力学响应mi RNA和硬度增加的力学生物学方式负调控内皮细胞功能、增加衰老血管疾病易感风险。

吴茱萸碱调节SDF-1α/CXCR4信号通路对颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的探究吴茱萸碱通过调节基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)/CXC趋化因子受体4(CXCR4)信号通路对颅内动脉瘤(IA)血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和凋亡的作用。方法24只小鼠随机分为对照组和IA组,每组12只。IA组通过定位手术注射弹性蛋白酶制造IA模型小鼠,然后通过HE染色观察动脉组织变化。随后将小鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS)先用MTT法检测吴茱萸碱浓度对细胞的活性影响,然后将MOVAS分为ctrl组、Model组(H_(2)O_(2)诱导损伤组)、低浓度吴茱萸碱组(0.50μmol/L)、高浓度吴茱萸碱组(1.00μmol/L)、高浓度吴茱萸碱+CTCE-0214组(1.00μmol/L吴茱萸碱+10 mg/kg SDF-1α/CXCR4激活剂)。CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测SDF-1α、CXCR4、BAX、增殖细胞核抗原(PCNA)、平滑肌22α(SM22α)和平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果与对照组正常动脉组织比较,IA组的IA组织出现明显的病理变化,损伤严重。在MOVAS细胞实验中,与ctrl组比较,Model组的细胞凋亡率、SDF-1α、CXCR4、BAX蛋白表达增加,而细胞存活率、PCNA、SM22α、α-SMA含量降低(P<0.05)。与Model组比较,低浓度吴茱萸碱组、高浓度吴茱萸碱组的细胞凋亡率、SDF-1α、CXCR4、BAX蛋白表达降低,而细胞存活率、PCNA、SM22α、α-SMA含量升高(P<0.05);与高浓度吴茱萸碱组比较,高浓度吴茱萸碱+CTCE-0214组细胞凋亡率、SDF-1α、CXCR4、BAX蛋白表达升高,而细胞存活率、PCNA、SM22α、α-SMA含量降低(P<0.05)。结论吴茱萸碱可能通过抑制SDF-1α/CXCR4信号通路进而抑制颅内动脉瘤血管平滑肌细胞的凋亡,促进其增殖。

机械应力调控血管平滑肌细胞的凋亡

背景:随着生物力学的发展,其在心血管疾病中的研究也日益广泛,通过研究血管的力学特性可以有效地揭示动脉粥样硬化、再狭窄等心血管疾病的发病机制,开发心血管疾病治疗的新思路和新方法。目的:综述机械应力刺激对血管平滑肌细胞凋亡的研究现状,寻找临床治疗潜在靶分子和信号通路,以期改善临床动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病的临床治疗效果。方法:检索1992年1月至2023年5月在中国知网、PubMed及ScienceDirect数据库收录的文献。中文检索词为“血管平滑肌细胞,机械应力,剪切力,牵张力,凋亡”;英文检索词为“vascular smooth muscle cell,mechanical stress,shear stress,stretch stress,apoptosis”,最终纳入63篇文献进行综述分析。结果与结论:①血管平滑肌细胞的生理性和病理性凋亡都是为了适应血管力学变化而发生的适应性重构。不同部位的平滑肌细胞承受不同的力学刺激,其发病机制也不同。②低剪切力、生理剪切力和高剪切力可通过直接与平滑肌细胞表面分子、受体及蛋白等作用调控凋亡信号分子和抑制增殖实现对血管平滑肌细胞凋亡的调控,该部分未对促进增殖的研究进行综述。③低牵张力、生理牵张力和高牵张力可导致平滑肌细胞凋亡,但仍存在争议。平滑肌表面存在多种力学感受分子(如整合素及受体络氨酸激酶等)可以将力学信号转导为细胞内的化学信号(如Hippo通路),启动平滑肌细胞的凋亡信号,调控平滑肌细胞的凋亡。④总之,不同力学刺激通过多种信号分子,启动多个信号通路共同作用,调控平滑肌细胞的凋亡,例如剪切力主要通过刺激分泌前列腺素、转化生长因子等影响Fas/FasL、Akt通路;而牵张力主要通过Yes相关蛋白等调控YAP通路和Notch通路等。这些分子在不同的作用时间,或不同作用强度下可能发挥相反的双向作用,比如,小鼠血管平滑肌细胞受到10%生理牵张1 h时,其增殖增加;然而,人的血管平滑肌细胞牵张12 h后可以减少其增殖。临床可以通过寻找其关键作用时间点干扰力学转导关键分子,达到预防和治疗临床心血管疾病的目的。

流体剪切力调控血管平滑肌细胞向巨噬样细胞表型转化促胸主动脉夹层形成的机制研究

目的胸主动脉瘤(TAA)与胸主动脉夹层(TAD)是一类严重危害人们身体健康和生命安全的重大疾病。目前,TAA和TAD的发病机制尚不清楚,更不了解TAA向TAD转化的分子机制。前期研究发现,在TAA向TAD演变的进程中,VSMCs发生巨噬样细胞表型转化,且受流体剪切力的调控。本研究旨在探明流体剪切力诱导VSMCs巨噬样细胞表型转化的力学生物分子机制,为解析TAA向TAD演变的机理提供新方向,为TAA和TAD的药物治疗提供新的分子靶标。方法对临床TAA和TAD样本进行单细胞测序及分析;基于医学影像数据模拟计算TAA和TAD病变部位的流体剪切力变化,并通过体外力学加载实验探究出合适的力学加载条件;在此基础上通过体内外力学加载实验流体剪力调控VSMCs表型转化的分子机制。结果数值模拟表明,VSMCs在TAA和TAD的血管组织中受到的流体剪力均值分别为1.0、40 dyn/cm^(2);流体剪切力显著下调PTCH1及上调GLI2的表达水平,该过程伴随VSMCs的巨噬样细胞表型转化;过表达PTCH1和抑制GLI2可显著阻碍流体剪力诱导的VSMCs巨噬样细胞表型转化,延缓TAA向TAD的转化进程。结论流体剪切力通过PTCH1-GLI2信号轴诱导VSMCs巨噬样细胞表型转化,从而促进TAA向TAD的演变。

沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨叉头框转录因子O1(FOXO1)基因对腹主动脉瘤(AAA)血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法:收集19例AAA患者动脉瘤组织(AAA组)及邻近正常主动脉组织(对照组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平,透射电镜观察2组研究对象动脉瘤组织中自噬溶酶体形成情况;Western blotting法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1及自噬相关蛋白卷曲螺旋肌球蛋白样B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)结合蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3α(LC3)和P62蛋白表达水平。体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(hVSMCs),并采用FOXO1 siRNA(si-FOXO1)及其阴性对照(si-NC)慢病毒感染hVSMCs,10μmol·L^(-1)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合自噬激活剂雷帕霉素(Rap)进行干预,将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+si-FOXO1组、AngⅡ+si-NC+Rap组和AngⅡ+si-FOXO1+Rap组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,ELISA法检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平,RT-qPCR法检测各组细胞中FOXO1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、Beclin1、LC3和P62蛋白表达水平。结果:与对照组比较,AAA组动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平升高(P<0.05),自噬溶酶体数量增多(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),P62蛋白表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,AngⅡ组hVSMCs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平降低(P<0.05);与AngⅡ+si-NC组比较,AngⅡ+si-FOXO1组hVSMCs增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平降低(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved-caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。与AngⅡ+si-FOXO1组比较,AngⅡ+si-FOXO1+Rap组细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:FOXO1基因沉默可能通过降低自噬水平来提高AngⅡ暴露下hVSMCs增殖活性,并抑制其凋亡,从而参与AAA的发病。

血管平滑肌细胞细胞程序性死亡在主动脉夹层中的研究进展与展望

主动脉夹层(AD)以胸背部剧烈疼痛为主要临床表现,是一种病情危急、发展迅速、病死率极高的心血管疾病,严重影响患者的生命安全。目前对于AD的发病机制研究主要集中在炎症反应、氧化应激、遗传因素等。近年来,研究发现血管平滑肌细胞(VSMC)死亡与AD的发生密切相关。因此,现以VSMC细胞程序性死亡为出发点,归纳目前已知的VSMC细胞程序性死亡类型、诱导因素及其在AD中的作用与发生机制,旨在探讨未来通过抑制VSMC细胞程序性死亡防治AD的潜在价值。

血管平滑肌细胞调节性死亡参与主动脉瘤发生发展的作用研究

主动脉瘤是一种以主动脉局部或弥漫病理性扩张达到正常血管直径1.5倍及以上为主要病理特征,在65岁以上老年人中患病率超过10%的临床常见大血管疾病^([1])。主动脉瘤一旦发生瘤体破裂,引发的失血性休克和血流动力学紊乱极其凶险,对人类生命健康构成重大威胁。然而,主动脉瘤通常发病隐匿,大多数患者在瘤体破裂时缺乏明显的临床症状。目前,尚无有效治疗的药物,外科手术是预防和应对瘤体急性破裂的主要手段。