用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素(英文)

为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9K。将人血管抑制素 (AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点 ,获得含AS基因的重组质粒 pGAP9K AS。转化P .pastorisGS115 ,对获得的高拷贝转化子P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)进行组成型表达 ,同时以诱导型转化子P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)作为对照。SDS PAGE结果显示 :组成型转化子于培养 4d后AS的表达水平已达到高峰 ,分泌量为 5 8mg/L ;而诱导型转化子诱导 4d后表达的AS仅是组成型表达的 70 % ,诱导 6d后达到高峰 ,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时 (4d)的 86 %。CAM分析和抗癌实验结果显示 :P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)和P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C5 7BL/ 6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长 ,其平均瘤重抑制率分别达到 90 6 1%和 90 5 4 %。以上结果表明 ,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点 ,PGAP可以取代PAOX1在P .pastoris中表达AS及其他外源蛋白。

针康法对局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损及缺血区碱性成纤维细胞生长因子、血管抑制素蛋白表达的影响

目的探讨针康法对局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损及缺血区碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和血管抑制素(AS)蛋白表达的影响。方法采用随机数字表法将90只清洁健康级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺治疗组、康复治疗组和针康治疗组,各组又分为3 d、7 d、14 d 3个亚组(n=6)。改良Longa法制备永久性脑缺血大鼠模型。模型组与假手术组不予任何治疗,针刺治疗组采用头穴丛刺疗法,康复治疗组采用跑台训练,针康治疗组采用针康法治疗。术后3 d、7 d、14 d采用改良神经功能缺损评分(m NSS)评估各实验组大鼠的神经功能,Western blotting法检测各实验组大鼠缺血半暗区b FGF和AS蛋白的表达。结果术后3 d、7 d、14 d,与模型组、针刺治疗组、康复治疗组比较,针康治疗组m NSS评分降低(P<0.05),b FGF蛋白表达升高(P<0.05),AS蛋白表达降低(P<0.05)。结论针康法能降低局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损,其机制可能与上调b FGF蛋白表达、下调AS蛋白表达有关。

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA文库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GS115 ,经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GS115 (pPIC9KA3)。再用G418筛选法 ,在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS_PAGE及Western印迹分析显示 :表达产物约占胞外蛋白的 43% ,相当于 94mg L ,并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。

中国人血管抑制素Endostatin基因的分子克隆与序列鉴定

目的：内抑素（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）是一种有效的血管生成抑制因子，分离、克隆和测定中国人的Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因，为进一步研究Ｅｎｄｏｃｔａｔｉｎ的功能奠定了基础。方法：从中国人胎肝组织中提取ｍＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ方法将Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的ｃＤＮＡ扩增出，克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，测定其ＤＮＡ序列。结果：中国人的Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ序列被成功克隆，序列分析证实为 Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因。结论：中国人的Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ基因编码序列与国外文献报道的相应序列完全一致。

血管抑制素对胃癌生长和转移抑制作用的实验研究

目的 研究血管抑素对胃癌生长和转移的抑制作用。方法 建立人胃癌裸鼠原位种植转移模型。结果 治疗组肿瘤体积、MVD明显低于对照组 (P <0 .0 5 ) ;治疗组抑瘤率、AI明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。胃癌转移受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,且与血管抑素剂量呈正相关。结论 血管抑素通过抑制血管生成 ,诱导胃癌细胞凋亡 。

探讨中药消岩汤联合重组人内皮血管抑制素配合化疗治疗乳腺癌作用机制研究

目的从体内和体外实验,观察中药消岩汤联合重组人内皮血管抑制素配合5-Fu对乳腺癌的治疗效果及作用机制。方法体外实验分为空白组、不同中药浓度及联合重组人内皮血管抑制素配合5-Fu组共10组,作用24h后,以MTT法检测MCF-7乳腺癌细胞的细胞增殖活性及用Hoechst33258法检测细胞的凋亡情况。体内实验分为空白对照组、消岩汤高剂量组、消岩汤低剂量组、5-Fu组、消岩汤高剂量+5-Fu组和消岩汤高剂量+重组人内皮血管抑制素+5-Fu组,分别予以干预措施,干预7天后处死,观察抑瘤率,小鼠体重变化及血清中瘦素水平变化。结果与对照组相比,各用药组均能不同程度地抑制细胞活性和促进凋亡,抑制肿瘤细胞增长,增加荷瘤小鼠体重,降低血清中瘦素水平含量,减少肿瘤周围新生血管生成,消岩汤联合重组人内皮血管抑制素及5-Fu组最优。结论消岩汤对重组人内皮血管抑制素配合化疗治疗乳腺癌有增效减毒作用。

血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

血管抑制素(A S)和内皮抑制素(ES)是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂,联合应用具有协同作用。本研究通过大肠杆菌表达A S-ES融合蛋白,观察其对血管生成的抑制作用。首先用RT-PCR方法分别获得A S和ES基因,通过基因拼接获得融合基因,构建了含有该融合基因的原核表达质粒——pET-42(b)/A S-ES。表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达,表达量为14%,分子量约65 KD。W estern b lotting检测表明表达产物可分别与A S和ES抗体产生特异的免疫反应。经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用。本研究获得了A S、ES在大肠杆菌中的融合表达,目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性。

人血管抑制素在酿酒酵母中的分泌表达和活性鉴定

将酵母交配因子 (MF)α1信号肽编码序列和人血管抑制素 (hAGN)cDNA融合序列插入穿梭载体pYADE4 ,构建得到分泌型重组表达质粒pYADEMA18.转化酿酒酵母JG110 7后 ,用 2 %乙醇和2 %甘油联合诱导表达 .ELISA分析表明 ,在诱导 14h～ 30h期间 ,hAGN获得了表达并分泌至细胞外 .发酵上清液经 75 %饱和度硫酸铵沉淀、CM 5 2纤维素离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析纯化 .SDS PAGE分析显示 ,表达产物重组人血管抑制素 (rhAGN)相对分子质量约 5 0kD ,电泳纯度达到 94 %.生物活性分析证明 ,rhAGN在 0 0 1mg L～ 3 0mg L浓度范围内能够抑制人真皮内皮细胞株HDMEC增殖 ,抑制作用随剂量的增加而增强 .

重组人内皮血管抑制素联合GP方案治疗晚期非小细胞肺癌疗效观察

目的观察重组人内皮血管抑制素(恩度)联合化疗药物在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中的治疗效果及安全性。方法选择本院就诊的82例晚期NSCLC患者,分为两组,A组患者使用恩度联合吉西他滨+顺铂(GP方案)治疗,B组患者使用吉西他滨治+顺铂治疗。对两组治疗效果以及毒副作用进行统计学分析。结果所有患者均完成两个周期治疗后评估疗效,其中A组患者有效率为42.1%,B组为29.5%,两组差异有统计学意义;毒副作用比较无明显统计学意义。结论恩度联合GP方案化疗较单纯化疗治疗晚期非小细胞肺癌患者效果更为显著,且无严重的毒副反应,值得临床进一步推广。

血管抑制素治疗脑胶质瘤的实验研究

目的 :探讨Angiostatin(血管抑制素 )抑制血管生成在治疗胶质瘤中的作用。 方法 :应用An giostatin分别作用于C6胶质瘤细胞系的体外培养细胞和动物肿瘤模型 ,计算细胞存活率及抑瘤率 ,SABC免疫组化技术检测体内胶质瘤中的微血管密度。结果 :Angiostatin不抑制体外培养胶质瘤细胞生长 ,细胞存活率为 10 0 % ,对体内生长的胶质瘤则有显著抑制作用且呈剂量依赖关系 ,抑瘤率可达 78 1% (P <0 .0 1)。经Angiostatin处理的胶质瘤中微血管密度较对照组降低 (P <0 .0 1)。 结论 :Angiostatin能抑制胶质瘤血管生成 。

血管抑制素对血管内皮细胞系ECV-304的抑制作用

目的 观察血管抑制素 (Angiostatin)对血管内皮细胞系ECV 3 0 4的抑制作用。 方法 利用MTT法分析结果 ,实验分为 :1 .将血管抑制素与细胞同时加入 ;2 .先接种细胞 ,培养 2 4h后再加血管抑制素。结果 血管抑制素对ECV 3 0 4的抑制作用呈典型的量效关系。结论 血管抑制素对血管内皮细胞有显著的抑制作用。

血管抑制素在肿瘤治疗中的研究进展

血管抑制素(angiostatin),又译为血管稳定素,为一种新型的肿瘤血管形成抑制因子。肿瘤的血管生成对于原发性肿瘤和转移性恶性肿瘤的生长至关重要。近年已发现了许多血管形成的生长因子和抑制因子。Hanahan等人于1996年提出了“血管形成开关的平衡假说”(balancehypothesis...

血管抑制素基因的克隆及表达

多年来,肿瘤的转移一直是肿瘤治疗的极大障碍,而血管抑制素(angiostatin)的发现很可能对肿瘤及其转移的治疗有重要意义。血管抑制素是从荷Luwis肿瘤小鼠血、尿中分离到的一种同源于纤维蛋白酶原内片段的多肽,在体外可抑制血管内皮细胞生长,在体内可显著抑制肿瘤组织转移及继发肿瘤的生长。

血管抑制素基因真核表达载体的构建及转染研究

目的：构建血管抑制素(angiostatin,AG)基因真核细胞表达载体并进行转染研究。方法：根据已发表的血管抑制素基因的核苷酸序列，设计并合成一对引物，以鼠的纤溶酶原核酸为模板进行PCR扩增，将其基因克隆到真核表达载体pRC／CMV中，进行序列分析和酶切鉴定后，运用脂质体将重组质粒pRC／CMV-AG转入胰腺癌SW1990细胞中，观察其表达情况,以及其对血管内皮细胞生长的作用。结果：PCR扩增出一长1.4 kb的片断，酶切和序列分析证明含完整的AG基因序列，与已知的血管抑制素基因的同源性很高（>96％）。Western blot证实重组体pRC／CMV-AG有较高的表达，对血管内皮细胞的生长有一定的抑制作用。结论：重组体pRC／CMV-AG是一种高效真核表达载体；克隆的AG基因能抑制血管内皮细胞的生长。

催乳素及血管抑制素对哺乳动物卵泡发育的调控作用研究进展

哺乳动物卵泡发育主要受到卵巢轴生殖激素的调控。催乳素(PRL)作为经典的生殖激素可通过内分泌途径调控卵泡发育,也可以作为细胞因子对卵泡发育起局部调控作用。高水平的PRL能够抑制促性腺激素释放激素(GnRH)和黄体生成素(LH)等激素分泌,从而抑制卵泡发育。近期研究表明,PRL具有促进血管发生的功能,对有腔卵泡发育具有促进作用;而PRL经组织蛋白酶(CTSD、BMP-1和MMPs)裂解可产生血管抑制素(Vi),PRL/Vi的相对水平对血管发生起到重要影响。本文主要对PRL及Vi的结构、分泌、作用机制及其在哺乳动物卵泡发育过程中可能的调节作用进行综述,可为探究动物卵泡发育的调控机制提供参考。

血管抑制素-2通过调控上皮细胞间质化促进宫颈癌细胞的增殖和转移

目的探讨血管抑制素-2(VASH2)能否促进宫颈癌细胞在体外的增殖和转移及其可能的分子机制。方法在外源性过表达和干扰内源性flotillin-1表达的宫颈癌细胞中,通过公共数据库结合RNA-seq挖掘分析差异表达基因;在宫颈正常上皮细胞(HcerEpic细胞)和宫颈癌细胞(HeLa、C-33A、Ca ski、SiHa和MS751)以及不同淋巴结转移状态的新鲜宫颈癌组织中检测VASH2的表达;运用慢病毒稳定表达载体构建外源性过表达VASH2和干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞及对照细胞,并检测其增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成的情况;在上述细胞模型中检测上皮细胞间质化(EMT)过程关键分子及TGF-β的表达水平。结果RNA-seq发现在外源性过表达flotillin-1的宫颈癌细胞中VASH2的表达上调(P<0.05),而在抑制内源性flotillin-1表达的细胞中VASH2表达下调(P<0.05),并在公共数据库中证实VASH2在有淋巴结转移的宫颈癌组织中相对于无淋巴结转移的癌组织呈高表达(P<0.01)。相对于HcerEpic细胞和淋巴结未转移的宫颈癌组织,VASH2在Ca Ski、SiHa、MS751细胞和有淋巴结转移的宫颈癌组织中表达上调(P<0.05);相对于对照细胞,外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成能力增强,而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞上述能力则受到抑制(P<0.05);相对于对照细胞,外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中EMT过程的关键分子E-cadherin下调,N-cadherin、Vimentin和VEGF-C上调,而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞中E-cadherin上调,N-cadherin、Vimentin和VEGF-C下调(P<0.05);外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平上调,而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平下调(P<0.001)。结论flotillin-1可能通过下游靶基因VASH2参与TGF-β信号通路诱导EMT过程在体外促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成。

血管抑制素功能结构域K1与PKA底物磷酸化基序的融合表达及磷酸化标记

通过 RT- PCR,从人肝组织中扩增出血管形成抑制素 ( angiostatin) c DNA的 K1片段 ,经DNA序列分析证实其正确性 ;将 K1与 GST融合并带上 1 7个氨基酸的 PKA底物磷酸化基序 ,IPTG诱导表达 ,以还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶亲合层析直接从细菌裂解上清中纯化融合蛋白 ;以 PKA催化单位将 3 2 P通过磷酸化作用标记至纯化的蛋白 ,再用凝血酶切去 GST,进行SDS- PAGE.放射自显影结果显示 ,GSTag- K1和 Tag- K1分别在 40 k D和 1 7k D处有信号强而特异的显影条带 ,表明带有磷酸化序列的蛋白能够被

重组人血管内皮抑制素联合脑部放疗与单纯脑部放疗治疗实体肿瘤脑转移的疗效及预后

目的探究重组人血管内皮抑制素(rh-Endostatin)联合脑部放疗(WBRT)与单纯WBRT治疗实体肿瘤脑转移的疗效及预后。方法回顾性分析2020-03—2022-11于资阳市人民医院肿瘤科治疗的94例患者的临床资料,根据治疗方式分为试验组和对照组,采用WBRT治疗的46例患者纳入对照组,采用rh-Endostatin联合WBRT治疗的48例患者纳入试验组,治疗结束1个月后比较临床疗效及肿瘤标志物指标[癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA125)、糖类抗原(CA19-9)、血管内皮生长因子(VEGFA、VEGFB、VEGFC)]、免疫功能(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、脑水肿体积和脑血流动力学参数(大脑前动脉平均血流速度和搏动指数)、生存质量[欧洲癌症研究治疗组织生命质量测定量表(EORTCQLQ)]、神经认知水平[简易精神状态量表(MMSE)],比较2组患者治疗期间放射性损伤,通过制作生存曲线分析患者预后情况。结果试验组患者治疗结束1个月时临床总有效率高于对照组(47.92%比26.09%),差异有统计学意义(P<0.05);2组患者治疗结束1个月时肿瘤标志物CEA、CA125、CA19-9、VEGFA、VEGFB、VEGFC水平,CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平,脑水肿体积、搏动指数均较治疗前显著降低(P<0.05),试验组患者肿瘤标志物水平和脑水肿体积显著低于对照组患者(18.76±2.54比20.78±3.12,26.78±4.98比33.12±5.19,31.34±3.12比37.24±3.98,90.76±16.97比121.78±18.12,83.78±11.02比105.23±12.19,65.34±9.12比83.23±10.98,144.58±71.55比203.87±70.59),CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平显著升高(59.67±4.33比55.41±4.02,31.22±3.34比27.74±3.79,1.17±0.22比0.96±0.15),差异均有统计学意义(P<0.05);2组患者CD8^(+)水平、大脑前动脉平均血流速度、EORTC各维度评分和MMSE评分相较治疗前均明显升高(P<0.05),试验组患者CD8^(+)水平明显低于对照组(27.02±3.08比28.92±3.31),大脑前动脉平均血流速度(56.67±3.33比55.01±2.06)、EORTC各维度评分和MMSE评分(26.58±1.11比25.87±1.17)明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);2组患者治疗期间均发生轻微放射性损伤,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后试验组患者中位总生存期(OS)和颅内疾病无进展期(iPFS)均明显长于对照组患者(9.5比7.5,8.0比6.0),差异有统计学意义(P<0.05)。结论rh-Endostatin联合WBRT治疗实体肿瘤脑转移患者可有效改善近期疗效,抑制肿瘤进展,改善脑血流,维持认知功能及生存质量,保护免疫功能。该方案安全性良好,可一定程度上延长患者的OS和iPFS。

重组人血管内皮抑制素联合奥希替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗效及预后分析

目的:分析重组人血管内皮抑制素联合奥希替尼对晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者疗效及预后的影响。方法:选择2020年06月至2022年02月医院就诊的晚期NSCLC患者92例,采用随机数字表法将其分成对照组与研究组,各46例。对照组接受奥希替尼治疗,研究组在对照组的基础上接受重组人血管内皮抑制素治疗。21 d为1个周期,2组均治疗3个周期评估效果。对比2组临床疗效、健康状况、生活质量、肿瘤标志物、肿瘤相关蛋白因子及不良反应,随访1年,记录2组无进展生存期(PFS)。结果:研究组客观缓解率(50.00%)高于对照组(26.09%)(P<0.05),研究组疾病控制率(76.09%)高于对照组(54.35%)(P<0.05)。治疗3个周期后,2组卡氏功能状态(KPS)评分、癌症治疗功能性量表(FACT-L)评分均升高(P<0.05),且研究组更高(P<0.05)。治疗3个周期后,2组血清细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、糖类抗原50(CA50)水平均降低(P<0.05),且研究组更低(P<0.05)。治疗3个周期后,2组磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)相对表达量均升高(P<0.05),且研究组更高(P<0.05);治疗3个周期后,2组血黏蛋白(MUC1)相对表达量均降低(P<0.05),且研究组更低(P<0.05)。2组Ⅰ-Ⅳ级消化道反应、血小板下降、肝肾功能损伤、中性粒细胞减少不良反应总发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。随访1年,2组均失访1例,随访率为97.83%,研究组中位PFS为8.97(95%CI:6.13~11.35)个月,对照组中位PFS为6.53(95%CI:3.85~9.61)个月,研究组PFS曲线优于对照组(P<0.05)。结论:重组人血管内皮抑制素联合奥希替尼治疗晚期NSCLC患者疗效确切,可降低肿瘤标志物水平,改善患者生活质量,调节肿瘤相关蛋白因子表达,安全可靠,且可延长患者PFS。