miR-96靶向血管生成素-1基因对子宫内膜异位症子宫内膜干细胞增殖的影响

目的研究miR-96靶向血管生成素-1(Ang-1)基因对子宫内膜异位症(EM)子宫内膜干细胞(EnSCs)增殖的调控作用。方法分离培养EM患者EnSCs,流式细胞仪检测EnSCs表面标志物,RTPCR检测EnSCs中miR-96和Ang-1的表达,Western blot检测Ang-1蛋白表达水平,miR-96 inhibitor转染EnSCs后,RT-PCR和Western blot检测miR-96、Ang-1和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-96与Ang-1的相互作用,MTT细胞增殖实验检测miR-96对EnSCs增殖的影响。结果 EnSCs表达CD140b和CD146,不表达CD31和CD34; EM患者EnSCs中miR-96和Ang-1的表达均较非EM明显升高(P <0. 01),且两者的变化具有正相关性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs中miR-96和Ang-1表达降低;miR-96能与Ang-1的3'UTR特异性结合,调控Ang-1的表达活性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs的增殖能力下降。结论 miR-96通过靶向Ang-1促进EnSCs的增殖,可能在EM的发病过程中发挥作用。

血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究

目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1(Ang-1)基因转染兔外周血血管内皮祖细胞(EPCs)的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组(EPCs)、EPCs+Ad空病毒载体对照组(EPCs+Ad)及EPCs+Ad-Ang-1组(EPCs+Ad-Ang-1)。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs+Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs+Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs+Ad组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。

重组血管生成素-Ⅰ基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的获得能稳定表达重组血管生成素-Ⅰ基因(Ang-Ⅰ)的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步观察其对急性肺损伤的保护作用奠定实验基础。方法提取人胎盘组织总RNA,RT-PCR扩增出Ang-Ⅰ基因片段,构建Ang-Ⅰ真核表达载体pEGFP-Ang-Ⅰ,利用脂质体介导转染大鼠MSCs,Western blot法检测转基因MSCs的Ang-Ⅰ蛋白表达情况。结果成功构建Ang-Ⅰ真核表达载体,并成功地将其转入MSCs中;MSCs细胞在转染pEGFP-Ang-Ⅰ质粒后,其培养上清中Ang-Ⅰ蛋白表达量显著升高。结论 Ang-Ⅰ基因成功转染至MSCs中,并可进行有效表达,此为进一步观察Ang-Ⅰ对急性肺损伤的保护作用奠定了实验基础。

VEGF-165/ANG-1双基因共转染血管内皮祖细胞复合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究

目的制备一种具有诱导血管再生活性的新型复合骨组织工程材料,并评价其生物相容性。方法将血管内皮生长因子-165(VEGF-165)/血管生成素-1(ANG-1)双基因共转染的血管内皮祖细胞(EPCs)复合多孔生物活性玻璃,制成复合人工骨材料。采用Western blot、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测已转染EPCs中VEGF-165及ANG-1的表达。噻唑蓝(MTT)细胞毒性试验、骨植入试验及扫描电镜观察细胞在材料表面黏附情况等综合评价材料的生物相容性;CD31免疫组织化学法染色观察材料中血管再生的情况。结果Western blot检测、RT-PCR反应显示,实验组VEGF-165、ANG-1的表达较对照组升高。MTT细胞毒性试验、骨植入试验均显示,材料无毒性反应。扫描电镜显示,材料表面有较多血管内皮祖细胞黏附,并有较多伪足伸出。苏木精-伊红染色法(HE)染色显示,材料周围组织生长良好,未见明显的炎症细胞浸润,材料与周围组织交界处有大量的新骨生成。CD31免疫组织化学法染色显示,材料中有较多新生的毛细血管。结论 VEGF-165/ANG-1双基因共转染EPCs复合多孔生物活性玻璃的骨组织工程材料生物相容性良好,具备一定的诱导血管再生活性。