血红素氧合酶-1基因转染对器官移植的作用研究

血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)是体内唯一催化血红素分解代谢的限速酶,可以氧化降解血红素,将其分解为CO、Fe2+和胆绿素。HO有3种同工酶,其中HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶,是唯一可以被诱导的HO。HO-1作为移植器官存活的关键"保护基因",通过基因转染使其稳定过表达,能显著减轻移植器官的缺血再灌注损伤,提高移植物存活率。

血红素氧合酶-1在器官移植中的保护作用

血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)是体内唯一一种催化血红素分解代谢的限速酶,他可以氧化降解血红素,将其分解为一氧化碳、自由铁和胆绿素．血红素氧合酶-1(HO-1)是唯一可以被诱导的血红素氧合酶,近年来大量的研究发现HO-1具有抗炎、抗凋亡、抗增生反应等多种保护作用．HO-1不仅可以在机体生理状态下发挥作用,更为重要的是他可以在机体非正常状态包括应激状态下被诱导,被认为是在细胞受损时维持其氧化和抗氧化动态平衡的关键因素．本文就HO-1在器官移植研究领域的细胞保护作用作如下综述．

血红素氧合酶-1在器官移植中的作用

本文简要介绍了血红素氧合酶-1(HO-1)在器官移植中抑制缺血再灌注损伤、调节T细胞活化增殖、抑制排斥反应、诱导免疫耐受等方面的作用,以及临床中HO-1表达的影响因素。

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的:克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒,进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。方法:实验于2007-02/12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只,腹腔注射氯化汞(1mg/kg)24h后,麻醉状态下取肾脏,从大鼠肾组织中提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,运用脂质体将重组质粒pcDNA3.1(+)-HO-1转染主动脉平滑肌细胞,通过反转录-聚合酶链反应和Westernblot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。结果:经双酶切及测序鉴定证明,正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Westernblot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。结论:①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。

血红素氧合酶-1基因转染对移植小肠的保护作用

目的观察重组腺相关病毒血红素氧合酶-1（HO-1）基因转染对移植小肠的保护作用。方法建立大鼠同种异位小肠移植模型，实验分为2组：实验组（n=34）：供体术前腹腔注射载有HO-1基因的腺相关病毒1．0×10^12个／ml，对照组（n=34）：供体术前腹腔注射腺相关病毒1．0×10^12个／ml，在实验组和对照组中检测小肠移植术后小肠组织中HO-1的活性、HO．1mRNA含量及细胞凋亡，免疫组织化学检测HO-1蛋白的表达，观察小肠组织病理学变化和受体生存时间。结果实验组平均生存时间为（6．80±1．56）d，对照组平均生存时间为（5．80±1．28）d，两者之间差异无统计学意义（P〉0．05），小肠移植术后24、48h和5d移植小肠实验组HO-1活性分别为2．11±0．04、1．90±0．04和1．56±0．05，均强于对照组（1．71±0．07、1．56±0．06和1．38±0．08，P〈0．05）；各组移植肠缺血再灌注损伤程度以术后24h最重，实验组缺血再灌注损伤程度轻于对照组：术后24h和48h实验组HO-1mRNA表达水平分别为1．12±0．08和0．76±0．10，均高于对照组（0．69±0．05和0．38±0．08，P〈0．05），术后5d HO-1mRNA表达水平两组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；术后各时段移植小肠细胞凋亡数实验组低于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），生存时间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论HO-1基因转染可降低移植小肠缺血再灌注损伤程度。

腺病毒介导的血红素氧合酶-1基因治疗对同种移植物慢性排斥反应损伤的保护作用

目的探讨腺病毒介导的血红素氧合酶-1(AdHO-1)基因治疗对同种移植物慢性排斥反应损伤的保护作用及其机制。方法选用血管移植和肾脏移植两种慢性排斥反应模型,对同种血管移植物和肾脏移植物进行体外 AdHO-1基因转染,分析慢性排斥反应发生时移植物的结构和功能变化、目的基因和蛋白的表达以及免疫系统的相应反应。结果 AdHO-1基因治疗缓解了慢性排斥反应对同种肾脏移植物的损伤,但弱于对血管移植物的保护效应;空载病毒加剧了同种。肾脏移植物的损伤;AdHO-1基因治疗可减少慢性排斥反应发生时移植物内巨噬细胞和 CD4^+细胞的浸润。结论AdHO-1基因治疗可能通过保护移植物、下调免疫反应、诱导免疫偏移等作用减轻同种移植物的慢性排斥反应损伤。

血红素氧合酶-1基因治疗减缓移植物血管病及机制

目的观察血红素氧合酶-1（HO-1）基因治疗减缓同种移植物血管病的效果，探讨其机制。方法以BN—Lewis大鼠血管移植为对象，依据基因治疗方案分为4组：同系对照组、空白对照组、载体对照组、腺病毒介导的HO-1（AdHO-1）组。移植后2个月，观察各组移植物纤维化和内膜增生，检测T细胞（CD3＋）、B细胞（CD45RA）和巨噬细胞（CD68＋）浸润数量，逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）和Westernblot检测移植物HO-1基因和蛋白的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测受体血清白细胞介素（IL）-10的浓度。结果同系对照组无移植物血管病表现，空白对照组和载体对照组大量纤维沉积，AdHO-1组纤维沉积轻微。血管内膜／（内膜＋中膜）百分比4组分别为7．6％、81．4％、85．9％、15．9％。每400倍视野浸润细胞数4组分别为T细胞（9．2±1．6、92．3±11．6、89．6±17．8、39．3±10．1）、B细胞（3．6±1．1、72．6±11．8、66．6±10．9、30．6±9．9）、巨噬细胞（7．5±1．2、78．5±21．7、72．5±19．8、34．5±18．7）。血清IL-10浓度4组分别为（50．2±20．1）、（40．2±11．1）、（38．6±19．3）、（481．2±69．1）ng／L。AdHO-1组与空白对照组和载体对照组间差异有统计学意义（P〈0．05）。AdHO．1基因治疗增高了移植血管HO．1基因和蛋白的表达。结论AdHO-1基因治疗减缓同种移植物血管病，移植物纤维化和内膜增生明显减轻。AdHO-1基因治疗下调了T细胞、B细胞和巨噬细胞在移植物中的浸润，增加了HO-1和IL-10的表达，IL-10-HO-1通路的活化可能是移植血管得到保护的重要原因。

血红素氧合酶-1抑制T淋巴细胞对血管内皮细胞的粘附作用

目的研究血红素氧合酶-1(HO-1)抑制T淋巴细胞对血管内皮细胞的粘附作用。方法采用脂质体介导基因转染技术将PcDNA3-HO-1质粒转入血管内皮细胞。用间接免疫荧光技术在蛋白质水平检测HO-1在血管内皮细胞上的表达;用γ-干扰素(INF-γ)活化血管内皮细胞;用CFSE标记植物血凝素(PHA)活化的JurkatT细胞;采用粘附阻断实验观察转染HO-1的血管内皮细胞和JurkatT细胞间的粘附作用。结果HO-1可在人血管内皮细胞系中稳定表达;转染HO-1的活化内皮细胞与JurkatT细胞的粘附作用显著下降,CFSE标记的阳性率为21.24%,而未转染的对照组CFSE标记的阳性率为56.16%,两组相比,差异有统计学意义(P<0.05);应用HO-1抑制剂ZnPP后,粘附抑制作用消失。结论HO-1可以明显抑制T淋巴细胞对血管内皮细胞的粘附作用。

缺氧条件下血红素氧合酶-1对肠黏膜屏障的保护作用

目的 观察缺氧条件下血红素氧合酶-1（HO-1）对肠黏膜屏障功能的影响.方法 HO-1真核过表达载体转染Caeo-2细胞,分为常氧组、缺氧组、转染组、质粒对照组.实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、Western blot方法检测肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin和HO-1的mRNA和蛋白的表达水平变化.免疫荧光法观察Occludin在细胞内的分布.结果 与常氧组比较,缺氧组Occludin的mRNA（0.43±0.03比1.0,P＜0.01）、蛋白（0.62±0.07比1.0,P＜0.01）表达水平均明显降低;与缺氧组比较,转染组Occludin的mRNA（0.65 ±0.04比0.43 ±0.03,P＜0.05）、蛋白（0.89±0.06比0.62 ±0.07,P＜0.05）表达水平明显升高;缺氧组与质粒对照组Occludin的mRNA（0.43±0.03比0.40±0.05,P＞0.05）、蛋白（0.62 ±0.07比0.61 ±0.04,P＞0.05）表达无明显变化.免疫荧光染色见Occludin沿细胞膜分布,呈线性荧光,缺氧引起其形态破坏,转染HO-1后破坏减轻.结论 缺氧条件下,HO-1可增加肠道紧密连接蛋白Occludin的表达水平,减轻缺氧对肠黏膜屏障的损伤.

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果。[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1(+)-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果。[结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-HO-1。RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上皮细胞并在细胞内有效表达。[结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1(+)-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础。

鼠ho-1真核表达载体的构建、鉴定及其在骨髓来源的内皮祖细胞中的表达

目的制备高效表达的血红素氧合酶（HO）-1基因修饰的骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）。方法应用基因重组的方法构建ho-1真核表达质粒pCMV—Tag2B／ho-1，用脂质体将其转入骨髓来源的EPCs，用荧光显微镜和Westernblot等方法检测HO-1蛋白的表达。结果（1）逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）产物电泳结果，质粒菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定结果证实ho-1真核表达质粒构建成功；（2）根据体外培养的骨髓来源的EPCs形态学变化，细胞的CD133、CD34和VWF免疫组织化学染色鉴定，VEGF诱导后LDL、UEA双染鉴定等证实所分离的细胞为EPCs；（3）vegfa转染P3代EPCs后细胞内荧光明显增强，Westernblot检测显示转染细胞HO-1蛋白抗体结合蛋白出现明显印迹条带。结论成功制备表达外源性基因ho．1的骨髓来源的EPCs，制备方法可行。