M1表型的小胶质细胞外泌体对血脑屏障功能的影响

目的:研究M1表型的小胶质细胞外泌体(M1 microglia-derived exosome,M1-exo)对体外血脑屏障(blood-brain bar⁃rier,BBB)功能及血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响。方法:用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质细胞来源的细胞系BV2细胞,流式技术检测其向M1型极化情况,分离提取外泌体。用小鼠脑微血管内皮细胞系b.End3细胞与原代培养的小鼠星形胶质细胞构建体外BBB模型,随机分为3组:b.End3细胞正常培养组(b.End3组)、b.End3细胞+25µg/mL正常BV2细胞来源外泌体(BV2-derived exosome,BV2-exo)组(b.End3+BV2-exo组)、b.End3细胞+25µg/mL M1表型的小胶质细胞来源外泌体组(b.End3+M1-exo组)。按实验分组将不同来源外泌体与BBB模型共培养,检测各组的跨膜电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)、荧光黄通过率,免疫印迹法(Western blot,WB)检测紧密连接复合物蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM蛋白的表达。结果:①小胶质细胞向M1型极化成功,其细胞标志物CD16/32阳性率较对照组明显升高(P=0.023);②与M1-exo共培养后,体外BBB模型的TEER明显下降(P=0.000),对荧光黄的透过率明显增加(P=0.000);③与b.End3组和b.End3+BV2-exo组相比,b.End3+M1-exo组的Claudin-1、Occludin及ZO-1蛋白的表达水平明显下降。结论:M1-exo可以破坏BBB的完整性,影响其功能。

血脑/血瘤屏障体外模型的构建、形态与功能特性

目的构建并观测血脑/血瘤屏障体外模型的形态与功能特性,为中枢神经系统药物跨血脑和(或)血瘤屏障研究提供体外实验模型。方法将分离的Balb/C小鼠脑微血管内皮细胞 (BMEC)在铺有明胶的微孔膜上单层培养或与大鼠胶质瘤细胞C6双室共培养,分别建立血脑屏障 (BBB)和血瘤屏障(BTB)模型,采用光镜和扫描电镜观察BMEC形态,采用Millicell-ERS系统检测屏障中的跨内皮电阻(TEERs),免疫细胞化学检测P-糖蛋白(P-gp)表达,并比较BBB和BTB中 BMEC的形态和功能特征。结果两组模型中的BMEC均形成单层生长和良好的细胞间紧密连接, 产生较高的TEERs值,并检测到P-gp表达。瘤细胞诱导使BMEC间出现间隙,同时相点TEERs值降低,P-gp表达减弱。结论两种体外模型可用于研究药物跨血脑和(或)血瘤屏障特性,其中BTB 模型可能更适合抗肿瘤药物的研究。

不同来源外泌体在阿尔兹海默病脑血管损伤中的作用研究进展

阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种常见的神经退行性疾病。AD脑血管损伤与脑内β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)沉积、神经炎症等病理的发生密切相关,严重影响了AD患者的生存。外泌体是一种由细胞分泌的小分子囊泡,能够介导细胞间货物转运和信号转导,并在多种生理和病理过程中发挥重要的调节作用。近年来,随着对外泌体的研究不断深入,不同来源的外泌体在AD脑血管损伤中的作用被发现,这也为研究AD的发病机制以及应用外泌体治疗AD提供了新的思路。因此,本文旨在对不同来源外泌体在AD脑血管损伤中发挥的作用研究进展做一综述。

血脑屏障体外实验模型的建立

目的 :应用培养的CBA/J小鼠脑血管内皮细胞 (brainmicrovascularendothelialcells,BMVEC)构建血脑屏障(blood brainbarrier,BBB)的体外实验模型。方法 :将BMVEC种植在明胶包被的 2 4孔板细胞插入器的微孔滤膜上培养至汇合状态 ,通过 4h液面渗漏实验、扫描和透射电镜、血脑屏障形成前后膜两侧的电阻以及辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase ,HRP)的通透性和RMP 7对血脑屏障通透性的调控作用来证实BBB的形成。结果 :BMVEC培养至汇合后 ,4h液面渗漏实验成为阳性 ;扫描电镜显示细胞形成单层 ,透射电镜证实细胞间形成紧密连接 ;跨细胞电阻 (thetransendothelialelectricalresistance ,TEER)分别为汇合前和人脐静脉内皮细胞的 3.2倍和 7.7倍 ;对HRP的通透率分别为前对照组的 1 3.4 %和 6 .7% ;RMP 7处理使HRP在BBB的通透率增加了 2 .7倍。结论 :构建的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性 。

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶———γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。

体外血脑屏障模型的建立

目的建立一种相对简单可靠、接近在体状态的SD大鼠体外血脑屏障模型。方法原代分离、纯化培养大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞,将两种细胞共培养建立体外血脑屏障模型。VIII因子、GFAP免疫组化鉴定细胞类型,相差显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察内皮细胞超微结构及紧密连接,γ计数仪测定核素标记牛血清白蛋白(125I-BSA)通透量检测血脑屏障(BBB)功能。结果VIII因子、GFAP免疫组织化学结果显示培养的脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞纯度分别为90%和99%以上。透射电镜显示内皮细胞间有高度发达的紧密连接、未见有W eible-Palade小体、少见吞饮小泡1。25I-BSA通透量结果显示,血脑屏障模型组在限制大分子量物质的能力上优于其他各组,与脑微血管内皮细胞单独培养组及空白对照组比较,差异有显著性意义(P<0.01)。结论利用同种属脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养,建立了一种简便可行、与在体血脑屏障结构类似,并具有在体血脑屏障的限制物质通透能力的SD大鼠体外血脑屏障模型。[中国当代儿科杂志,2005,7(6):526-529]

冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响

目的探讨冰片开放血脑屏障的机制。方法制备含冰片的家兔血清 ,应用马丁达比狗肾上皮细胞系作为血脑屏障的体外模型 ,观察冰片对血脑屏障细胞间紧密连接、细胞吞饮囊泡的影响。结果冰片能使血脑屏障体外模型细胞间紧密连接结构减少、细胞吞饮囊泡数量增加、粒径增大 ,冰片血清处理 4h后先打开细胞间紧密连接 ,处理 2 4h后才对细胞吞饮造成影响 ;移除冰片血清 2 4h后上述影响即消失 ,说明上述作用具有可逆性。结论冰片能明显使血脑屏障细胞间紧密连接松散 ,使物质经细胞间通道转运加速 ;冰片能明显使血脑屏障细胞吞饮小泡数量增多、体积增大 。

建立体外共培养血脑屏障模型评价纳米粒的胞吞转运和毒性(英文)

目的建立大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCECs)和星形胶质细胞共培养模型,评价纳米粒的跨血脑屏障(BBB)转运和对内皮细胞紧密连接的毒性。方法采用复乳/溶媒蒸发法制备载荧光探针6-香豆素的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒。首先,分别从新生鼠大脑分离培养BCECs和星形胶质细胞并进行免疫组化鉴定。然后,将BCECs接种于细胞培养池微孔膜的上面,将星形胶质细胞接种于膜下面建立共培养模型。分别测定14C-蔗糖和纳米粒的渗透系数。结果载6-香豆素纳米粒的平均重均粒径为(102.4±6.8)nm,zeta电位为(-16.81±1.05)mV。BCECs的VIII因子表达呈阳性;星形胶质细胞的胶质原纤维酸性蛋白表达呈阳性。模型的跨内皮细胞电阻值为(313±23)Ω.cm2。扫描电镜和透射电镜观察发现,共培养模型中的BCECs形成紧密连接。纳米粒的质量浓度低于200μg.mL-1时,不影响14C-蔗糖渗透系数的改变,表明其不会影响BBB内皮细胞的紧密连接。10μg.mL-1载6-香豆素纳米粒的渗透系数为0.29×10-3cm.m in-1。结论该大鼠BBB模型与体内情况接近,适合用于评价纳米粒的脑内转运和毒性。

铅诱导血脑屏障体外模型中紧密连接相关蛋白的信号调控

目的研究铅损伤体外血脑屏障(BBB)模型的紧密连接过程中,MAPK、AKT通路的改变,并观察相关通路的抑制剂的调节作用。方法利用TranswellTM小室培养系统将ECV304人脐静脉内皮细胞系与C6大鼠胶质瘤细胞共培养建立体外BBB模型。共培养实验组按照加入醋酸铅(PbC4H6O4)浓度的不同分组。测量跨内皮阻抗(TEER)和FITC-葡聚糖通过量,以动态TEER峰值和FITC-葡聚糖通过量作为判断ECV304细胞紧密连接形成的标准。Western blot法检测铅暴露对细胞紧密连接相关蛋白表达的影响;利用免疫荧光细胞化学染色检测紧密连接相关蛋白的细胞定位;染铅细胞MAPK、PI3K/AKT通路抑制作用。结果铅对ECV304细胞的生长具有抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05);随着培养时间延长,TEER的测定值不断下降,而FITC-葡聚糖通过量显著上升(P<0.05);Western blot法检测发现,在2.5μmol/L铅作用条件下,ECV304细胞和C6细胞共培养体系中ECV304细胞中的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平逐渐下降;p38、ERK、AKT的磷酸化水平逐渐增强;采用免疫荧光细胞化学染色发现ECV304细胞紧密连接相关蛋白表达减弱,信号通路抑制剂抑制铅诱导的信号通路活化,ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY2940021可抑制铅诱导的紧密连接相关蛋白表达降低。结论铅可诱导BBB通透性增强,MAPK、AKT通路抑制剂可抑制BBB通透性。

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC)建立体外血脑屏障模型,探讨跨血脑屏障(blood brainb arrier,BBB)电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB/c小鼠脑血管内皮细胞,通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型,采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律,紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测,比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与3H葡萄糖通透性的关系等方法,探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的"铺路石"样外观;扫描电镜显示细胞形成致密单层,透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞间形成光滑、连续、高密度的紧密连接;3H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关,内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低,通透率最低时跨细胞电阻为(346±10)Ω/cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。

补肾益精方含药血清对β-淀粉样蛋白干预血脑屏障体外模型渗透性的影响

目的:以Aβ1-42干预血脑屏障大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养模型,评价补肾益精方含药血清对该模型的渗透性的影响。方法:体外分别培养胚胎鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞,鉴定并测定跨内皮细胞电阻,利用Transwell细胞培养池,建立内皮细胞和星形胶质细胞共培养的血脑屏障体外模型,将5μmol/L Aβ1-42加入大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞非接触式共培养血脑屏障模型。分为Aβ1-42模型组和Aβ1-42加补肾益精方低、中、高剂量组,另设血脑屏障空白组,分别检测并比较各培养组荧光素钠的渗透性。结果:补肾益精方低、中剂量组荧光素钠的通透性明显低于Aβ1-42模型组(P<0.05)。结论:补肾益精方含药血清对Aβ1-42诱导的血脑屏障渗透性增加有抑制作用。

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用

目的构建体外血脑屏障模型,并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系b END.3构建体外血脑屏障模型,并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型,以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照,比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值(TEER)检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低,新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强,血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99,黑色素酶缺陷株lac1裣穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异;尿素酶缺陷株ure1裣效率显著下降(P<0.05),约为标准株H99通过率的59.9%;荚膜缺陷株cap59裣突破体外血脑屏障模型效率最低,约为标准株H99的18%(P<0.001)。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。

缓激肽对胶质瘤血瘤屏障体外模型中钙激活钾电流的作用

目的建立胶质瘤血瘤屏障体外模型,研究缓激肽(BK)对胶质瘤血瘤屏障钙激活钾电流(Ikca)的作用,探讨BK开通血瘤屏障的机制。方法条件培养和共培养,膜片钳全细胞记录。结果条件培养的脑微血管内皮细胞(BMECs)形态无明显变化,胶质瘤C6细胞之间相互接触紧密。共培养的BMECs和C6细胞各自聚集,之间形成界面,1μmol.L-1缓激肽使BMECs和C6细胞界面内钙激活钾电流下降。结论1μmol.L-1的缓激肽抑制部分血瘤屏障体外模型BMECs和C6细胞的钙激活钾电流。

利用体外血脑屏障模型结合高压液相-质谱技术筛选传统中药——朝鲜淫羊藿有效成分(英文)

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是位于中枢神经系统(central nervous system,CNS)和中枢系统环境间的一层生理保护屏障.凡是作用于CNS的药物,必须先通过BBB.为了寻找能够进入CNS的药物,通过细胞培养时间优化和跨膜电阻测定等,建立了ECV304/C6共培养通过BBB药物筛选模型.并将该模型应用于从传统中药淫羊藿的提取物中,筛选可能作用于CNS的活性成分,结合高压液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS),对筛选出的化合物进行鉴定分析.研究结果表明,淫羊藿提取物中至少有13种成分能够穿越BBB模型,其中2种成分被确认为淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ,为CNS药物开发的早期快速筛选提供了实验依据.

体外血脑屏障模型的构建及致脑膜炎粪肠球菌对其的影响

试验旨在探索致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障功能的影响,寻求稳定的构建体外血脑屏障损伤模型的方法。选用1周龄ICR小鼠进行原代脑微血管内皮细胞(BMEC)分离并通过BMEC特有的凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FactorⅧ)进行荧光标记,鉴定分离的细胞并判定分离率。选用1~3日龄ICR小鼠分离星形胶质细胞并通过其特有的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)对进行荧光标记,鉴定分离的细胞并判定分离率。将原代细胞传至3代,用Transwell二维小孔分别构建单层BMEC和BMEC与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。选用致脑膜炎粪肠球菌、非致脑膜炎粪肠球菌和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别与构建的体外血脑屏障模型共培养,评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的穿透性。通过4 h渗透试验、荧光素钠通透性试验和血脑屏障损伤相关标志基因基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达量的检测,评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的影响。结果显示,试验成功分离到BMEC和星形胶质细胞,纯度分别达90%和95%以上。细菌穿透试验结果显示,所选的3株细菌只有致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型。4 h渗透试验和荧光素钠通透性试验结果显示,共培养模型优于单层BMEC模型。与其他组相比,构建的体外血脑屏障与致脑膜炎粪肠球菌共培养组荧光素钠的穿透力更高,MMP-2基因的表达量明显上升。综上,BMEC与星形胶质细胞共培养的模型优于单层BMEC模型,致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型,并介导体外血脑屏障损伤,本试验结果为揭示致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障损伤机制提供了理论依据。

12外泌体对体外血脑屏障模型功能的影响

目的 在体外建立血脑屏障模型,研究非小细胞肺癌a549细胞来源的外泌体对血脑屏障模型功能的影响。方法 利用小鼠脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞建立体外血脑屏障模型。模型建立后通过4 h渗漏实验鉴定是否成模。建模成功后分为对照组与实验组,将利用超速离心法及Exo-spin试剂盒分离提纯的非小细胞肺癌A549细胞培养基中外泌体接种至实验组Transwell上室,置于培养箱孵育,分别于共培养24 h、48 h、72 h后进行跨内皮电阻检测实验及48 h辣根过氧化物酶渗透试验,以评估体外血脑屏障模型的功能。结果(1)80%血脑屏障模型在建立建模成功;(2)2组TEER值比较24 h后2组间差异无统计学意义(P > 0.05);48 h后实验组TEER降低,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01);72 h后实验组TEER进一步降低且与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01);(3)共培养48 h后实验组通透性较对照组明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 人非小细胞肺癌细胞外泌体可以影响小鼠体外血脑屏障模型的功能,人非小细胞肺癌细胞外泌体可使BBBM通透性增加。

血脑屏障体外模型的研究进展

血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周皮细胞等组成的动态生理结构,在维持中枢系统内环境稳态中发挥着重要作用。体外实验其高效、灵敏、快速、稳定等特点使其成为候选药物高通量筛选及生理病理机制研究的首选方案。该文主要对体外血脑屏障模型的种类、组成及应用进行评述,结合国内外文献报道,记述了经典模型的同时,详细描述了大量国内外的最新模型及先进技术,为中枢神经系统药物筛选及体外血脑屏障机制研究提供参考。

血脑屏障体外模型构建研究进展

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)作为体内最重要的防御结构之一,其完整的结构和功能仍缺乏更细致深入的研究。有效的血脑屏障体外模型则是研究其具体构成和功能的有效工具。本文主要对血脑屏障结构、功能及体外模型构建进行综述,为血脑屏障的深入研究提供理论基础。

血脑屏障体外模型研究进展

脑毛细血管上的特殊结构单元为大脑提供氧气和养分,与此同时形成一种限制性屏障,称为血脑屏障(BBB),该结构单元由单层脑微血管内皮细胞构成,内皮细胞外侧的周细胞、基膜以及星形胶质细胞的足突也参与了血脑屏障的形成.血脑屏障是一种选择性渗透屏障,大多数中枢神经系统候选药物在血脑屏障中的渗透性差,用实验动物进行药物筛选具有成本高、周期长、成功率低等缺点.此外,直接在人体中试验有违道德伦理,但建立可靠的体外血脑屏障模型可以简化实验过程、缩短试验周期、实验结果更易测定,因此建立体外BBB模型可以极大地加快中枢神经系统药物的研发.目前已研究的模型主要可以分为3类:单培养、共培养、三培养,这些模型由简单到复杂,与体内血脑屏障的相似性也越来越高.本文就目前现有的血脑屏障模型进行综述,以期未来在体外BBB模型设计中有新的思路.