人类非小细胞肺癌细胞对小鼠体外血脑屏障模型功能的影响

目的:建立体外血脑屏障模型(blood-brain barrier model,BBBM),观察非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞对BBBM功能的影响。方法:早上将周细胞(pericytes,PC)接种到Transwell膜的外侧面,星形胶质细胞(astrocytes,AS)接种到12孔板内,8 h后将Transwell置入12孔板内,再将小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)接种到transwell膜的内侧面,建立血脑屏障模型。模型建立后每天进行试漏试验及跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定,鉴定是否成模。成模后分为对照组与实验组,将A549细胞接种到实验组BBBM内室,共培养体系置于培养箱,于24 h、48 h、72 h后进行电阻测定及辣根过氧化物酶渗透试验,以评估BBBM的功能。分别于渗透试验进行至2 h、6 h时取样,根据样本中辣根过氧化物酶浓度计算表观渗透系数(apparent permeability coefcient,Papp)。结果:(1)部分血脑屏障模型在建立后3 d成模,4 d可全部成模。(2)A549细胞加入BBBM内室共培养。(a)实验组TEER值与对照组比较:1 d后无显著变化(P>0.05);2 d后降低出现统计学差异(P<0.05);3 d后降低具有统计学差异(P<0.01);(b)渗透试验与对照组比较:1 d后2 h及6 h渗透试验实验组Papp均降低,但无统计学差异(P>0.05);2 d后实验组Papp升高,2 h渗透试验差异具有统计学意义(P<0.05),6 h渗透试验差异无统计学意义(P>0.05);3 d后实验组Papp升高,2 h及6 h渗透试验均具有显著统计学差异(P<0.01)。结论:小鼠体外血脑屏障模型的功能可被人类非小细胞肺癌细胞影响。体外共培养体系可用于研究肺癌脑转移过程中肿瘤细胞与脑微血管内皮细胞间相互作用的分子机制。

微流控芯片技术在血脑屏障模型构建中的应用进展

血脑屏障(BBB)是由脑内的血管内皮细胞以及星型胶质细胞、周细胞、基底膜共同构成的致密屏障结构,对于维持中枢神经系统内环境的稳定起到至关重要的作用,但BBB的存在也使得大部分药物不能进入中枢神经系统发挥作用,所以构建一种既能模拟在体环境又能进行可重复性实验的体外BBB模型具有十分重要的意义,从而实现药物的高通量筛选。微流控芯片技术作为上个世纪90年代影响最为深远的科学技术之一,具有将生物、化学等实验室的基本功能,例如样品制备、反应、分离和检测等微缩在一块芯片上的能力,越来越多的科研人员用其构建BBB模型,根据屏障结构的细胞组成不同分为单一内皮细胞模型及内皮细胞、星型胶质细胞共培养模型和内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞共培养模型。

12外泌体对体外血脑屏障模型功能的影响

目的 在体外建立血脑屏障模型,研究非小细胞肺癌a549细胞来源的外泌体对血脑屏障模型功能的影响。方法 利用小鼠脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞建立体外血脑屏障模型。模型建立后通过4 h渗漏实验鉴定是否成模。建模成功后分为对照组与实验组,将利用超速离心法及Exo-spin试剂盒分离提纯的非小细胞肺癌A549细胞培养基中外泌体接种至实验组Transwell上室,置于培养箱孵育,分别于共培养24 h、48 h、72 h后进行跨内皮电阻检测实验及48 h辣根过氧化物酶渗透试验,以评估体外血脑屏障模型的功能。结果(1)80%血脑屏障模型在建立建模成功;(2)2组TEER值比较24 h后2组间差异无统计学意义(P > 0.05);48 h后实验组TEER降低,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01);72 h后实验组TEER进一步降低且与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01);(3)共培养48 h后实验组通透性较对照组明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 人非小细胞肺癌细胞外泌体可以影响小鼠体外血脑屏障模型的功能,人非小细胞肺癌细胞外泌体可使BBBM通透性增加。

Epsin2基因沉默对小鼠内皮细胞体外血脑屏障模型的影响

目的:研究使用小干扰RNA(siRNA)特异性沉默体外血脑屏障模型中小鼠脑微血管内皮细胞系b. End3细胞中Epsin2的表达后对血脑屏障模型的功能及VEGFR2、ZO1、occludin表达的影响。方法:使用化学合成的siRNA特异性干扰b. End3细胞Epsin2的表达,免疫荧光、Western Blot检测转染后细胞Epsin2、VEGFR2、ZO1、occludin的表达。体外血脑屏障模型分为对照组(control)和Epsin2-siRNA干扰组(Epsin2-siRNA),Control组使用正常b. End3细胞建立体外血脑屏障模型,Epsin2-siRNA组使用Epsin2-siRNA转染后b. End3细胞建立体外血脑屏障模型,分别于建模24、48、72 h后进行跨内皮电阻测定,48 h辣根过氧化物酶(HRP)渗透试验测定血脑屏障模型功能。结果:转染后b. End3细胞Epsin2免疫荧光和Western Bolt结果均提示表达下降(P <0. 05)。随着Epsin2的表达下降,VEGFR2表达随之下降,ZO1、occludin表达上升(P <0. 05)。Epsin2-siRNA组TEER值与Control组比,48 h后Control组与Epsin2-siRNA组TEER均升高,但Epsin2-siRNA组升高幅度高于Control组,差异有统计学意义(P <0. 05);72 h后Epsin2-siRNA干扰组TEER进一步升高且与Control组相比差异有统计学意义(P <0. 05);共培养48 h后Epsin2-siRNA干扰组通透性明显低于Control组,且有统计学差异(P <0. 05)。结论:Epsin2的表达能够影响血脑屏障相关分子的表达,从而影响血脑屏障功能。

M1表型的小胶质细胞外泌体对血脑屏障功能的影响

目的:研究M1表型的小胶质细胞外泌体(M1 microglia-derived exosome,M1-exo)对体外血脑屏障(blood-brain bar⁃rier,BBB)功能及血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响。方法:用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质细胞来源的细胞系BV2细胞,流式技术检测其向M1型极化情况,分离提取外泌体。用小鼠脑微血管内皮细胞系b.End3细胞与原代培养的小鼠星形胶质细胞构建体外BBB模型,随机分为3组:b.End3细胞正常培养组(b.End3组)、b.End3细胞+25µg/mL正常BV2细胞来源外泌体(BV2-derived exosome,BV2-exo)组(b.End3+BV2-exo组)、b.End3细胞+25µg/mL M1表型的小胶质细胞来源外泌体组(b.End3+M1-exo组)。按实验分组将不同来源外泌体与BBB模型共培养,检测各组的跨膜电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)、荧光黄通过率,免疫印迹法(Western blot,WB)检测紧密连接复合物蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM蛋白的表达。结果:①小胶质细胞向M1型极化成功,其细胞标志物CD16/32阳性率较对照组明显升高(P=0.023);②与M1-exo共培养后,体外BBB模型的TEER明显下降(P=0.000),对荧光黄的透过率明显增加(P=0.000);③与b.End3组和b.End3+BV2-exo组相比,b.End3+M1-exo组的Claudin-1、Occludin及ZO-1蛋白的表达水平明显下降。结论:M1-exo可以破坏BBB的完整性,影响其功能。

β-毒素促进金黄色葡萄球菌破坏血脑屏障的实验研究

目的 探讨β-毒素(Hlb)在金黄色葡萄球菌通过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)中的作用。方法 通过血琼脂平板划线筛选金葡菌MW2的Hlb高产菌株,验证其对hCMEC/D3模拟BBB细胞模型通透性的影响。采用生物信息学分析筛选hlb基因完整的金葡菌菌株,利用同源重组的方法构建hlb敲除株,血琼脂平板法检测溶血活性改变。利用BBB细胞模型比较不同菌株对其通透性的影响,再将野生株与hlb敲除株经尾静脉注射构建小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型并比较感染72 h脑组织中菌载量。结果 金葡菌MW2的Hlb高产菌株对BBB细胞模型破坏导致BBB细胞模型通透性增加的能力较野生株明显增强。NCTC8325-4、COL和RN4220菌株hlb基因无噬菌体插入。成功构建NCTC8325-4Δhlb株,血平板证实敲除株的β-溶血缺失。NCTC8325-4Δhlb株对BBB模型细胞破坏导致BBB细胞模型通透性增加的作用较野生株下降,在小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型脑组织中菌载量也较野生株明显降低。结论 β-毒素具有促进金葡菌破坏BBB的作用。

不同血脑屏障模型的建立及其功能特点

目的比较不同类型体外血脑屏障模型(blood brain barrier model,BBBM)的建立及其屏障功能特点,为构建血脑屏障(BBB)毒性筛检模型提供选择依据。方法以Wistar乳鼠脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells,BCECs)和星型胶质细胞(astrocytes,As)共培养构建BBBM;以渗漏试验、跨内皮细胞阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)测量和荧光黄(lucifer yellow,LY)通透性试验评判模型的屏障功能。结果建立分别与12孔和24孔板相匹配的各4种BBBM:单细胞模型、接触模型、非接触模型和间接模型。镜下细胞融合完整的模型,渗漏试验结果呈阳性;各模型TEER于细胞融合完整后的2～4 d到达峰值。其中以接触模型和非接触模型的TEER最为突出,12孔、24孔接触模型TEER值分别为(241±4.5)、(297±5.6)Ω/cm2;12孔、24孔非接触模型TEER值分别为(233±5.6)、(273±4.6)Ω/cm2。4种模型中,12孔接触模型和非接触模型具有较低的通透系数(permeability coefficient,Pe),其值分别是(0.92±0.07)×10-3cm/min和(1.06±0.05)×10-3cm/min。结论 12孔BBB非接触模型的建立周期短、屏障特征明显,且易于实施通透性测试操作,可作为构建BBB毒性筛检模型的优先选择。

重组组织型纤溶酶原激活剂在血脑屏障氧糖剥夺体外模型中对神经细胞的保护作用

目的探讨重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)在体外血脑屏障氧糖剥夺模型中对神经细胞的保护作用。方法利用Transwell培养小室为支架,构成以人血管上皮细胞为基础的体外血脑屏障(BBB)模型;利用厌氧培养箱及无糖培养液,建立体外缺血缺氧模型;在体外缺血缺氧模型基础上,采用组织培养技术培养神经细胞,并在缺血缺氧条件下,使用MTT法检测不同剂量的rt-PA对神经细胞活性的影响。结果分别在氧糖剥夺(OGD)及无氧糖剥夺non-OGD条件下,在不同rt-PA的浓度作用下,低浓度(0.312 5μg/ml)rt-PA对non-OGD条件下神经细胞的生长有促进作用;在OGD条件下,低浓度(0.625μg/ml,0.312 5μg/ml)对神经细胞同样具有保护作用。结论 rt-PA可能对脑缺血后神经细胞存在保护作用,并与rt-PA的剂量相关。在OGD条件下,低剂量的rt-PA对神经细胞的保护作用更为显著。

rt-PA在血脑屏障氧糖剥夺体外模型中对神经细胞保护的研究

目的观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)在体外血脑屏障氧糖剥夺模型中对神经细胞的影响,探讨rt-PA对脑缺血神经元的保护作用。方法利用Transwell培养小室为支架,构成以人血管上皮细胞为基础的体外血脑屏障模型;利用厌氧培养箱及无糖培养液,建立体外缺血缺氧模型;在体外缺血缺氧模型基础上,采用组织培养技术,培养神经细胞,并在缺血缺氧条件下,使用MTT法进行检测不同剂量rt-PA对神经细胞活性的影响。结果分别在氧糖剥夺实验(OGD)及非OGD条件下,在不同rt-PA药物的浓度作用下,低浓度(0.312 5μg/mL)对非OGD条件下神经细胞的生长有促进作用,在OGD条件下,低浓度(0.625μg/mL,0.312 5μg/mL)对神经细胞同样具有保护作用。结论 rt-PA可能对脑缺血后神经细胞存在保护作用,并与rt-PA的剂量相关,在OGD条件下,低剂量rt-PA对神经细胞的保护作用更为显著。

两种血脑屏障模型通透性指示剂使用效果比较

目的比较辣根过氧化物酶(HRP)和荧光黄(lucifer yellow,LY)在血脑屏障模型(blood brain barrier model,BBBM)通透性测定中的使用效果。方法将Wistar乳鼠脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells,BCECs)和星型胶质细胞(astrocytes,As)进行共培养建立非接触BBBM;利用通透性试验进行HRP和LY对BBBM通透系数(permeability coefficient,Pe)的测定。结果建立分别与12孔和24孔板相匹配的非接触BBBM。通透性测试显示,HRP组Pe值(12孔和24孔板模型)低于LY组。HRP和LY对BBBM的Pe分别为(0.64±0.05)×10-3、(1.67±0.07)×10-3cm/min(12孔、24孔模型)和(1.08±0.16)×10-3、(3.03±0.13)×10-3cm/min(12孔、24孔模型)。结论 HRP和LY作为指示剂均能用于BBBM通透性定量测定。但LY使用简便性,安全性较高,实际中可作为优先选择。

铅诱导血脑屏障体外模型中紧密连接相关蛋白的信号调控

目的研究铅损伤体外血脑屏障(BBB)模型的紧密连接过程中,MAPK、AKT通路的改变,并观察相关通路的抑制剂的调节作用。方法利用TranswellTM小室培养系统将ECV304人脐静脉内皮细胞系与C6大鼠胶质瘤细胞共培养建立体外BBB模型。共培养实验组按照加入醋酸铅(PbC4H6O4)浓度的不同分组。测量跨内皮阻抗(TEER)和FITC-葡聚糖通过量,以动态TEER峰值和FITC-葡聚糖通过量作为判断ECV304细胞紧密连接形成的标准。Western blot法检测铅暴露对细胞紧密连接相关蛋白表达的影响;利用免疫荧光细胞化学染色检测紧密连接相关蛋白的细胞定位;染铅细胞MAPK、PI3K/AKT通路抑制作用。结果铅对ECV304细胞的生长具有抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05);随着培养时间延长,TEER的测定值不断下降,而FITC-葡聚糖通过量显著上升(P<0.05);Western blot法检测发现,在2.5μmol/L铅作用条件下,ECV304细胞和C6细胞共培养体系中ECV304细胞中的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平逐渐下降;p38、ERK、AKT的磷酸化水平逐渐增强;采用免疫荧光细胞化学染色发现ECV304细胞紧密连接相关蛋白表达减弱,信号通路抑制剂抑制铅诱导的信号通路活化,ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY2940021可抑制铅诱导的紧密连接相关蛋白表达降低。结论铅可诱导BBB通透性增强,MAPK、AKT通路抑制剂可抑制BBB通透性。

基于微流控芯片的体外血脑屏障模型构建

目的:利用微流控芯片技术构建易调控、接近在体微环境的体外血脑屏障模型。方法:微流控芯片体外模型采用上下双培养池结构,由多聚碳酸酯膜分隔,两套流路系统控制流体。细胞采用原代分离纯化的大鼠脑血管内皮细胞和星形胶质细胞,免疫荧光技术进行鉴定,分别按次序注入微流控芯片上下培养池,按1μl/min的流速进行灌注培养,构建体外血脑屏障模型,并对此模型进行鉴定和评价。结果:原代分离纯化得到两种细胞,免疫荧光法鉴定细胞纯度达95%以上。共培养3天紧密连接开始形成,5天达到峰值,超微结构观察显示内皮细胞之间形成紧密连接,且荧光素钠渗透实验和TEER值测量表明屏障形成良好。结论:成功构建微流控芯片体外血脑屏障模型,可成为一个新的平台应用于药物筛选、神经系统基础等多项研究中。

血脑屏障体外模型的研究进展（综述）

血脑屏障(BBB)是位于中枢神经系统(CNS)和中枢系统环境间的一层生理保护屏障。对于治疗脑部疾病的药物来说,需要先通过BBB才能起效。BBB体外模型则是研究药物的BBB透过性或评价脑靶向纳米粒的脑部递药特性的有效工具。近年来,体外BBB模型的应用日趋广泛并在脑部疾病相关研究中发挥着重要作用。该文综述了国内外体外血脑屏障模型的发展现状及其在应用方面的最新研究进展。

探讨脂多糖诱导的中枢神经系统炎症反应对体外血脑屏障功能的影响

目的利用bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞及星形胶质细胞建立体外血脑屏障模型,并观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的中枢炎症对血脑屏障功能的影响。方法培养小鼠原代脑微血管星形胶质细胞,利用流式细胞术对原代星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白进行细胞纯度鉴定后,将其与bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞进行共培养构建体外血脑屏障模型。将小鼠原代星形胶质细胞、bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞、共培养的血脑屏障模型均分为对照组和LPS处理组。LPS处理浓度为20μg/ml,处理时间为24 h。通过跨内皮细胞电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)检测血脑屏障功能,Western blot检测血脑屏障连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白含量。结果原代培养的星形胶质细胞呈典型的多突起形态,流式细胞学鉴定细胞纯度为96%。三种细胞分别进行LPS处理后,TEER值均较各自对照组明显下降(P<0.05),Occludin和ZO-1蛋白相对表达量均较各自对照组明显下降(P<0.05)。结论bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养可成功建立一种体外血脑屏障模型,LPS诱导的中枢神经系统炎症反应会使血脑屏障完整性受损,破坏其功能。

神经生长因子脂质体跨血脑屏障体内外研究

目的 研究神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)脂质体在体外血脑屏障 (blood brainbarrier,BBB)模型上的通透性以及在体内脑组织的分布 ,并对体内外结果进行相关性分析。方法 用小鼠脑微血管内皮细胞 (BMVEC)建立的BBB体外实验模型 ,研究NGF脂质体在体外模型上的通透率 ;1 2 5I NGF和SDS PAGE法联合使用研究NGF脂质体在脑组织的分布。结果 NGF脂质体的最高包封率为 34% ,平均粒径小于 10 0nm。脂质体能够增加NGF在BBB模型上的通透率 ,以NGF SSL T为最大。脑组织药物浓度次序为NGF SSL T >NGF SSL +RMP 7>NGF SSL。体内外结果具有良好相关性。结论 脂质体能够增加NGF跨越BBB的能力 ,RMP 7偶联在脂质体上 (NGF SSL T)效果好于RMP 7与脂质体的简单混合 (NGF SSL +RMP 7)。

血脑脊液屏障转运体研究方法的进展

血脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barrier)已被公认为是一个横亘在脑和血液之间的具有动态及高度组织化特性的界面,其主要目的是防止溶质自由通行和通过孤立它的外围来保护中枢神经系统,其功能异常会先于或者加速一些神经系统疾病的恶化。血脑脊液屏障转运体的研究为解析血脑脊液屏障的功能、探索神经系统相关疾病的发病机制及促进脑部为靶向药物研发提供理论依据。该文主要对血脑脊液屏障转运体的分类和功能、血脑脊液屏障模型及转运体研究方法进行了概述,为中枢神经系统药物的新药设计、提高药物靶向性和药物相互作用等研究提供借鉴。

利用体外模型评价外来化学物对血脑屏障通透性的影响

目的利用体外模型评价15种化学物对血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性的影响。方法建立血脑屏障模型(blood-brain barrier model,BBBM),利用模型进行15种目标化学物的通透性试验。计算通透系数(Permeability Coefficient,Pe)以考察化学物暴露致血脑屏障通透性改变情况。结果建立了非接触式血脑屏障模型。通过通透性试验求得15种化学物Pe值,其中乙酸铅、硝酸铅、硫酸铝、硫酸锰、乙酸锌、氯化镉和秋水仙素Pe值分别为(2.54±0.47)、(1.78±0.27)、(2.12±0.23)、(1.45±0.43)、(1.11±0.25)、(1.23±0.09)和(1.52±0.42)×10-3 cm/min,显著高于对照组Pe值(1.02±0.09)×10-3cm/min。结论乙酸铅、硝酸铅、硫酸铝、硫酸锰、乙酸锌、氯化镉和秋水仙素7种化学物体外测试显示能够显著增大血脑屏障通透性,提示应予以关注。

血脑屏障药物筛选模型的建立及丹参活性成分筛选分析

ECV304细胞在C6细胞的诱导下生长,通过细胞培养时间优化、渗透系数测定和细胞形态学观察等,建立ECV304/C6共培养血脑屏障(BBB)药物筛选模型.将该模型应用于从丹参提取液中筛选可能作用于中枢神经系统(CNS)的活性成分,结合液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分析,发现丹参提取液中至少有16种成分能够穿越BBB模型,其中4种成分被确认为隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参素和原儿茶酸.通过定量构效关系(QASR)分析,进一步从理论上证明所确认的4种化合物均符合CNS靶向药物的特征.研究结果表明,ECV304/C6共培养BBB模型能够在模拟生理状态下从中药复杂体系中筛选分离跨越BBB的活性成分组,可用于CNS药物开发的早期快速筛选,服务于中药现代化研究.

实验性血脑屏障细胞模型及其评价

目的 :建立模拟在体血脑屏障 (blood brainbarrier ,BBB)形态、功能的体外细胞模型。方法 :将纯化的 1型星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞分别接种于涂有鼠胶原的Transwell多聚酯膜两侧 ,共培养。分别检测共培养后BBB特异性酶γ 谷氨酰转酞酶 (γ GT)含量 ;测定荧光素钠 (FLU)、12 5Ⅰ 牛血清白蛋白 (BSA)在该模型上的通透量。结果 :共培养后内皮细胞表现出典型细胞形态 ;γ GT含量随共培养酶活性增强 ;模型对大分子蛋白质和小分子物质都具有良好限制通透的作用。结论 :脑微血管内皮细胞与 1型星形胶质细胞共培养能够形成与在体BBB类似的结构 ,并具有在体屏障的限制物质通透。

血脑/血瘤屏障体外模型的构建、形态与功能特性

目的构建并观测血脑/血瘤屏障体外模型的形态与功能特性,为中枢神经系统药物跨血脑和(或)血瘤屏障研究提供体外实验模型。方法将分离的Balb/C小鼠脑微血管内皮细胞 (BMEC)在铺有明胶的微孔膜上单层培养或与大鼠胶质瘤细胞C6双室共培养,分别建立血脑屏障 (BBB)和血瘤屏障(BTB)模型,采用光镜和扫描电镜观察BMEC形态,采用Millicell-ERS系统检测屏障中的跨内皮电阻(TEERs),免疫细胞化学检测P-糖蛋白(P-gp)表达,并比较BBB和BTB中 BMEC的形态和功能特征。结果两组模型中的BMEC均形成单层生长和良好的细胞间紧密连接, 产生较高的TEERs值,并检测到P-gp表达。瘤细胞诱导使BMEC间出现间隙,同时相点TEERs值降低,P-gp表达减弱。结论两种体外模型可用于研究药物跨血脑和(或)血瘤屏障特性,其中BTB 模型可能更适合抗肿瘤药物的研究。