盐酸多西环素对重组质粒pBI-EGFP-hHO-1表达的调控

目的构建Tet-off调控的血色素氧化酶-1(HO-1)真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1,并确定盐酸多西环素对其表达的调控剂量。方法利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pBI-EGFP连接构成重组质粒。NheI和MluI双酶切鉴定后采用RT-PCR技术及免疫细胞化学的方法检测其在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达情况。利用RT-PCR技术检测Tet-off和pBI-EGFP-hHO-1双转染后不同浓度盐酸多西环素对hHO-1基因mRNA表达量的影响,确定该四环素调控系统的盐酸多西环素诱导量。结果用NheI和MluI双酶切证明hHO-1成功克隆入应答质粒pBI-EGFP;RT-PCR、免疫细胞化学检测结果表明重组质粒在SMMC-7721细胞中表达;经RT-PCR检测显示当盐酸多西环素浓度≥2 000 ng/ml时,HO-1基因mRNA表达降低,与未转染组接近。结论成功构建了由Tet-off调控的真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1,并确定盐酸多西环素对其调控剂量为2 000 ng/ml。