自噬在镉致小鼠睾丸血-睾屏障损伤中的作用

目的:探究自噬在氯化镉致小鼠睾丸血-睾屏障(BTB)损伤中的作用。方法:将20只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组[0 mg/(kg·d)]、低剂量组[0.5 mg/(kg·d)]、中剂量组[1.0 mg/(kg·d)]和高剂量组[2.0 mg/(kg·d)],腹腔注射氯化镉,连续28 d。采用HE染色法分析睾丸组织形态学变化,生物示踪法观察BTB的完整性,Western印迹检测BTB组分ZO-1和N-Cadherin蛋白的表达。采用0、2.5、5和10μmol/L CdCl_(2)处理睾丸支持细胞株(TM4细胞)24 h,Western印迹检测ZO-1和N-Cadherin蛋白,以及自噬相关蛋白LC3II和p62的变化情况。在含CdCl_(2)(10μmol/L)的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂氯喹(CQ)(5μmol/L)或自噬激动剂雷帕霉素(Rap)(50 nmol/L)处理细胞24 h,Western印迹检测LC3II、p62、ZO-1和N-Cadherin蛋白表达。结果:与对照组小鼠相比,镉染毒组小鼠的生精小管间隙增大、生精细胞内空洞形成,层次减少、排列紊乱,BTB完整性受到破坏;中、高剂量CdCl_(2)组小鼠的睾丸组织中ZO-1和N-Cadherin蛋白表达含量显著下调(P<0.05)。与对照组细胞相比,CdCl_(2)染毒组细胞中ZO-1和N-Cadherin蛋白表达显著下调(P<0.01),而LC3II和p62蛋白表达则显著上调(P<0.05)。与CdCl_(2)组细胞相比,自噬抑制剂CQ和CdCl_(2)共处理组细胞中ZO-1、N-Cadherin、LC3II和p62蛋白表达均显著上调(P<0.01);自噬激动剂Rap和CdCl_(2)共处理组细胞中ZO-1、N-Cadherin和p62蛋白表达显著下调(P<0.05),而LC3II蛋白表达上调(P<0.05)。结论:氯化镉可破坏小鼠BTB的完整性,其机制可能与镉能够增强睾丸支持细胞中自噬水平,调控BTB蛋白表达含量相关。

电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血-睾屏障的影响

采用常规苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE staining)、硝酸镧示踪电镜和埃文思兰 (Evans Blue,EB)尾静脉注射三种方法,综合观察100kV／m和400kV／m两种不同强度电磁脉冲辐射对小 鼠睾丸血-睾屏障的影响。三种方法观察结果基本一致,两种强度的电磁脉冲辐射均可造成小鼠睾丸支持细胞和 血一睾屏障不同程度的损伤,400 kV/m辐射组损伤更甚,辐射后1 d即可见大量生精细胞的凋亡与坏死,支持细 胞亦发生形态结构的变化,血-睾屏障严重损伤,随后大量第Ⅷ期生精小管内出现基底室与近腔室的分离,大量 凋亡与坏死的生精细胞向管腔的排放,至辐射后21d仍可见到血-睾屏障损伤;100kV/m辐射组的损伤较 400 kV/m辐射组稍轻,辐射后14 d支持细胞、生精上皮以及血-睾屏障的损伤已基本恢复。结果提示一定强度 的电磁脉冲可以造成小鼠血-睾屏障的损伤,这种损伤呈辐射强度依赖性,并且与损伤后恢复时间相适应。

单侧精索静脉曲张模型大鼠双侧睾丸Claudin-11表达及血-睾屏障变化的实验研究

精索静脉曲张(varicocele,VC)是青年男性常见病,也是导致男性不育的重要原因,目前对VC致男性不育的机制仍未能阐明。Claudin-11是睾丸中的跨膜蛋白,也是构成血-睾屏障最基本的分子结构,通过Claudin-11蛋白间的相互作用可调节生殖细胞的增殖和迁移,对于维持精子生成十分重要[1]。本研究旨在通过建立大鼠左侧VC模型,并检测双侧睾丸间质细胞表达Claudin-11的水平.

慢性镉中毒小鼠睾丸支持细胞及血-睾屏障超微结构观察和形态计量研究

用透射电镜观察并结合形态计量法研究慢性镉中毒时小鼠睾丸支持细胞及血－睾屏障的超微结构。结果表明：（１）支持细胞明显受损，细胞核增大，细胞器出现变性，有的支持细胞呈现坏死。（２）血－睾屏障各部分受损，间质内血管内皮细胞变性、坏死、剥脱；生精小管基膜增厚、分裂成层；管周组织内胶原原纤维显著增多；相邻支持细胞间紧密连接破坏。从形态结构方面考虑，认为血－睾屏障的瓦解可能是引发生精异常的主要原因。

血-睾屏障损伤的影响因素及其相关机制

血-睾屏障由相邻支持细胞间多种蛋白质复合体组成,它通过在生精上皮参与构建生精微环境、提供免疫屏障并赋予细胞极性来维持正常精子发生。血-睾屏障的结构与功能易受外界不良环境因素影响,但血-睾屏障损伤的影响因素及其相关机制尚未系统阐明。本综述概括血-睾屏障的结构、功能及生理调控机制,总结损伤血-睾屏障的化学、物理、生物因素,并归纳不良环境因素通过影响表观遗传修饰、信号通路表达、细胞因子与内分泌激素含量损伤血-睾屏障结构与功能的相关机制,这对于保障精子质量、避免睾丸损伤具有重要的指导意义,也为预防男性不育提供理论依据。

睾丸动脉血流障碍对小鼠睾丸生精上皮和血－睾屏障的影响

目的：探讨睾丸动脉血流障碍对小鼠睾丸生精上皮和血-睾屏障的影响.方法：成熟雄性BALB/c小鼠,随机分为对照组和6个实验组,对照组仅暴露睾丸动脉而不进行结扎,实验组显微镜下行单侧睾丸动脉结扎, H-E染色观察睾丸组织的病理改变,电镜观察血-睾屏障的变化.结果：对照组睾丸生精小管无明显病理改变;1h组睾丸生精小管上皮细胞排列不均匀,细胞界限清楚,线粒体轻微肿胀,核周隙轻微增宽,睾丸生精小管的基膜完整;2h和3h组生精小管生精细胞层数减少,线粒体轻微空泡改变,线粒体嵴扩张,支持细胞内质网扩张明显,有局部液化灶,生精小管基膜轻微波纹状;睾丸间质可见炎性细胞浸润,多为分叶的中性粒细胞;4h和5h组睾丸间质血管中充血明显,血管内壁有大量的炎性细胞贴壁现象,血管壁增厚呈玻璃样变,精原细胞有核碎裂现象,细胞界限不清,基膜间隙增宽,基膜皱折,精子细胞顶体位置未见顶体,精子细胞局部有空泡,界限不清,细胞膜不完整;6h组睾丸生精小管内主要为精原细胞和初级精母细胞,精原细胞与基膜脱离,基膜有＂分层＂现象,支持细胞、精母细胞肿胀明显,细胞膜不完整,界限不清,生精小管内可见多核巨细胞.结论：单侧睾丸动脉结扎/再通可引起睾丸生精细胞的缺血性损伤和坏死,生精上皮细胞和血-睾屏障的病理变化随缺血时间的延长而加重.

温度对体外大鼠睾丸支持细胞增殖及occludin蛋白表达的影响

目的:通过观察不同温度对原代大鼠睾丸支持细胞增殖作用与紧密连接蛋白occludin(OCLN)表达的影响,探讨温度因素在男性生殖功能降低或男性不育中的作用机制。方法:体外分离培养雄性Wistar大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC),油红O染色及免疫组化FasL鉴定。实验分为对照组(34℃)和实验组(35℃、36℃、37℃、38℃、39℃)。在相应的温度下培养4 d后,CCK-8法检测SC增殖作用,HE染色观察细胞形态及结构,Western印迹法和免疫荧光法检测OCLN表达水平。结果:体外培养SC的纯度为(96.20±1.95)%,CCK-8结果显示,细胞增殖活性在34～36℃时逐渐增强,36～39℃时逐渐降低,并在镜下观察发现细胞核固缩、裂解明显;免疫荧光及Western印迹显示,36℃时OCLN表达量最高;高于36℃时,OCLN表达量随着温度的增加而降低(P<0.01)。结论:温度升高(>36℃)抑制SC的增殖活性,并降低SC紧密连接蛋白的表达量。因此,高温对SC活性和紧密连接完整性的影响,可能是导致男性生育能力下降或不育的机制之一。

电磁脉冲辐射对小鼠睾丸Occludin表达的影响

探讨电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血-睾屏障紧密连接蛋白Occludin表达的变化。采用场强为400 kV/m的辐射场对30只成年雄性Balb/c小鼠进行200次重复全身照射,另30只假照射。于辐照后1、7、l4、21和28d分别取小鼠睾丸组织制备石蜡标本或提取组织蛋白和mRNA,使用Real-time PCR、Western-blotting和间接免疫荧光检测Occludin的表达及其变化。结果显示:与正常对照组相比,辐照组小鼠睾丸中Ocludin mRNA和蛋白的表达水平在辐照后1、7和14 d均明显降低。提示电磁脉冲辐射能够降低血-睾屏障紧密连接蛋白Occludin的表达,直接导致小鼠睾丸血-睾屏障的损伤。

邻苯二甲酸二丁酯的毒性作用及机制

针对环境污染日益严重的现状,探讨了邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的肝脏与生殖毒性作用.检测了血浆和肝脏中的关键酶、精子活动力与畸形率,观察了肝脏和睾丸的病理改变.结果表明,DBP可以显著升高谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(AKP)和丙二醛(MDA),显著降低超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),表明DBP会诱发小鼠肝脏发生脂质过氧化过程,引起早期的肝脏损伤.DBP能够穿透血-睾屏障,干扰精子的生长和发育过程.因此,DBP是一种对雄性生殖细胞具有潜在诱变危害的遗传毒性化合物.

闭合蛋白的胞外环缺失对小鼠TM4细胞紧密连接的影响分析

目的:分析闭合蛋白的2个胞外环结构域在小鼠TM4细胞紧密连接中的功能。方法:利用基因工程的方法,分别或者同时缺失掉闭合蛋白的2个胞外环,将缺失了胞外环3个闭合蛋白基因序列,分别克隆入pcDNA3.1表达载体,再转入TM4细胞。用RT-PCR和Western印迹分析闭合蛋白表达量,用紧密连接的体外细胞模型来分析闭合蛋白的胞外环对紧密连接程度的影响。结果:测序结果表明pcDNA3.1-occludinΔOCC1、pcDNA3.1-occludinΔOCC2和pcDNA3.1-occludinΔOCC1+OCC2表达载体已经构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示3个缺失组闭合蛋白的mRNA和蛋白质的表达量都显著高于对照组。体外紧密连接模型分析结果表明闭合蛋白2个胞外环都能够增加TM4的紧密连接程度,其中,pcDNA3.1-occludinΔOCC1转染组每天的大分子通过率均比pcDNA3.1-occludinΔOCC2转染组显著降低(P<0.05),表明闭合蛋白第二个胞外环对紧密连接的影响程度比第一个胞外环要高。结论:闭合蛋白2个胞外环都能够影响小鼠TM4细胞紧密连接的程度,并且第二个胞外环对紧密连接的影响程度比第一个胞外环要高。

免疫不孕症的病因病机与治疗近况

精子具有抗原性,在某种情况下暴露于机体免疫系统诱发机体产生抗精子抗体(AbAs),导致免疫性不孕(育)症。男女双方或一方存在AbAs,均可导致不孕不育或造成反复流产。目前,西医多采用免疫抑制剂或人工授精等方法治疗,长期使用糖皮质激素有一定的副作用,而人工受精由于条件限制,很多医院不能开展。中医通过辨证论治治疗该病,取得显著疗效,妊娠率在25%～56.7%之间。

组织液的成分和生理

组织液是细胞生存的直接内环境。不同组织和器官中，组织液的成分和容量的不同，决定了生理功能的差异。相同的组织和器官中，组织液的成分和容量维持相对的稳定，才能保证生理功能的正常进行。组织液中各组成成分浓度的变化，是细胞对外界刺激产生反应的直接表现。这些变化信息将通过神经体液的负反馈调节机制，在呼吸系统、消化系统和排泄系统的协同配合下，使内环境保持相对稳定。另外，在一些特殊的组织和器官，细胞与外界环境之间存在一定的生理屏障，如血－脑屏障和血－睾屏障，这对维持细胞的特殊功能具有重要的生理意义。