衔接子相关蛋白激酶1(AAK1)抑制剂抗病毒研究进展

病毒作为一种主要的感染源能够感染从细菌、植物、动物到人类的所有生物体。由病毒引起的传染性疾病对人类健康及经济活动造成了巨大的威胁和损害。衔接子相关蛋白激酶1(AAK1)是丝氨酸/苏氨酸激酶的Ark1/Prk1家族的成员,也是调控AP-2蛋白μ2亚基T156磷酸化的特异性关键激酶。过去,人们一直把对AAK1的调控作为治疗神经疼痛的可行性生物靶点。近期科学家们发现抑制AAK1可以调控胞吞作用,进而抑制病毒入侵细胞。因此,AAK1可能是抗病毒的一个潜在靶点。本文综述了小分子AAK1抑制剂在抗病毒领域的研究进展,剖析未来的研究方向和挑战,为开发靶向AAK1的抗病毒药物提供新思路。

AAK1相互作用蛋白的筛选及其调控细胞内整体翻译水平的研究

目的·探究衔接子相关蛋白激酶1(adaptor-associated protein kinase 1,AAK1)新的相互作用蛋白,以及除网格蛋白介导的内吞作用外AAK1介导的生物学功能。方法·通过在HEK-293T细胞中分别外源性转染带有标签的AAK1载体与空白对照载体,利用标签特异性的琼脂糖凝胶进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CoIP),并联合质谱分析的方法获得潜在与AAK1相互作用的蛋白;通过CoIP初步验证质谱结果;通过荧光共聚焦成像观察AAK1与其潜在结合蛋白在细胞内的空间定位;通过体外纯化重组蛋白,利用谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降实验(glutathione-S-transferase pulldown,GST Pulldown)进一步明确蛋白间是否为直接的相互作用;通过嘌呤霉素结合实验观察AAK1对于细胞内整体翻译水平的调控作用。结果·质谱结果提示AAK1可能与以脆性X相关蛋白1(fragile X mental retardation syndrome-related protein 1,FXR1)、FXR2、脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein 1,FMRP)三者为核心的一系列蛋白形成复合体。外源性转染AAK1-3xFLAG及FMRP-MYC质粒,利用抗FLAG琼脂糖凝胶富集AAK1-3xFLAG后,可以检测到FMRPMYC的表达;利用内源性抗体进行CoIP,发现富集AAK1可以检测到FMRP的表达。荧光共聚焦成像显示EGFP-AAK1与mCherry-FMRP在细胞质中存在部分空间共定位。GST Pulldown显示FMRP可以直接沉淀HIS6-AAK1重组蛋白。嘌呤霉素结合实验显示相同时间内嘌呤霉素标记的细胞内新合成肽段数量与AAK1蛋白表达量呈正相关。结论·AAK1与FMRP在细胞质内存在直接的相互作用,且AAK1可以提高细胞内的翻译水平。

LncRNA MALAT1通过靶向miR-146a调节PI3K/Akt信号通路影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)通过调节miR-146a对胃癌(gastric cancer, GC)细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法 收集GC组织和配对正常胃上皮组织,将GC细胞MNK-45分为空白对照(blank control, BC)组(未转染)、MALAT1 siRNA-NC组(转染MALAT1 siRNA-NC)、MALAT1 siRNA组(转染MALAT1 siRNA)、miR-146a mimics-NC组(转染miR-146a mimics-NC)、miR-146a mimics组(转染miR-146a mimics)、MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor-NC组(共转染MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor-NC)、MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor组(共转染MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor)。定量荧光PCR(qRT-PCR)检测胃组织或细胞中MALAT1、miR-146a表达量;CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;RNA pull down实验、双荧光素酶报告实验分析MALAT1和miR-146a的结合情况;Western blot检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路蛋白及c-Myc、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)蛋白表达量。结果 转染MALAT1 siRNA可明显降低MNK-45细胞的MALAT1表达量,敲低MALAT1或过表达miR-146a可降低细胞活力、克隆能力、迁移和侵袭,增加miR-146a表达,降低PI3Kp85α、PI3Kp85β、c-Myc、MMP9蛋白表达量及p-Akt/Akt水平;MALAT1可结合并靶向下调miR-146a表达;低表达miR-146a可逆转敲低MALAT1对MNK-45细胞增殖、迁移和侵袭的抑制效应。结论 MALAT1可能作为ceRNA吸附并降解miR-146a,敲低MALAT1可上调miR-146a表达,并通过PI3K/Akt通路抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭。

LAIR-1通过阻断JAK2 V617F突变的人HEL细胞JAK/STAT和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制其增殖并促进其凋亡

目的研究人白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)对Janus激酶2(JAK2)V617F突变的人急性髓系白血病HEL细胞JAK/信号转导子与转录激活子(STAT)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路的调节作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法采用反转录PCR和基因测序鉴定JAK2 V617F突变;应用免疫共沉淀和Western blot法鉴定LAIR-1募集的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)种类;采用CCK-8法检测HEL细胞的增殖;采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测HEL细胞的凋亡率;采用Western blot法检测JAK/STAT和PI3K/AKT/mTOR通路蛋白酪氨酸磷酸化水平及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bcl2相关X蛋白(BAX)和B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)的蛋白表达。结果在JAK2 V617F突变的HEL细胞中,LAIR-1与其配体胶原蛋白结合后可募集含Src同源域2磷酸酶2(SHP-2);LAIR-1可以下调HEL细胞JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、AKT和mTOR的蛋白酪氨酸磷酸化水平,并能够显著抑制cyclin D1和Bcl2的表达,而对BAX的表达水平未见显著影响;LAIR-1能够明显抑制HEL细胞的增殖,促进HEL细胞凋亡。结论在JAK2 V617F突变的人白血病HEL细胞中,LAIR-1可通过募集SHP-2抑制JAK/STAT和PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化,进而抑制HEL细胞的增殖,促进细胞凋亡。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子高表达对视网膜微血管内皮细胞的影响

目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子(PSF)高表达对低浓度4-羟基壬烯醛(4-HNE)诱导下人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的影响,初步探讨其可能存在的机制。方法将体外培养的对数生长期HRMECs分为4-HNE处理组、PSF高表达联合4-HNE组(PSF+4-HNE组)、PSF高表达+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)联合4-HNE组(PSF+ML385+4-HNE组)、磷酸肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后4-HNE联合PSF组(LY294002+4-HNE+PSF组)。4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组细胞培养基加人10μmmol/L4-HNE刺激12h,PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000将1.0μgpcDNA-PSF真核表达质粒导入细胞中转染24h后,PSF+ML385+4-HNE组加入ML385(5μmol/L)预处理48h。LY294002+4-HNE+PSF组,除采用LY294002预处理外,4-HNE浓度、刺激时间以及质粒转染时间同前。Transwell检测PSF对HRMECs迁移能力的影响;Matrigel体外三维成型法检测PSF对HRMECs管腔形成的影响;流式细胞仪检测PSF对HRMECs中活性氧(ROS)水平的影响;蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测PSF、Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白相对表达量以及磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(pAkt)蛋白相对表达量。两组间比较采用t检验。结果4-HNE处理组、PSF+4-HNE组细胞数、迁移细胞数、完整管腔形成数分别为(1.70±0.06)、(0.80±0.13)个,(24.00±0.58)、(10.00±0.67)个和(725.00±5.77)、(318.70±12.13)个。两组细胞数、迁移细胞数、完整管腔形成数比较,差异均有统计学意义(t-12.311、15.643、17.346,P<0.001)。流式细胞仪检测结果显示,4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、PSF+ML385+4-HNE组ROS水平分别为816.70±16.67、416.70±15.44、783.30±17.41;组间两两比较,差异均有统计学意义(t=16.311、14.833、18.442,P<0.001)。Westernblot检测结果显示,4-HNE处理组、PSF+4-HNE组、LY294002+4-HNE+PSF组HRMECs中pAkt、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量分别为0.08±0.01、0.57±0.04、0.35±0.09,0.17±0.03、1.10±0.06、0.08±0.11,0.80±0.14、2.50±0.07、0.50±0.05。与PSF+4-HNE组比较,LY294002+4-HNE+PSF组pAkt、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(t=17.342、16.813、18.794,P<0.001)。结论PSF高表达通过活化磷酸肌醇3激酶/Akt通路上调HO-1的表达,从而抑制低浓度4-HNE诱导的HRMECs增生迁移和管腔形成。