中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析

测定了 30年来从不同动物中分离的 19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列 ,并对其核苷酸差异做了比较分析。可将中国狂犬病病毒街毒株分为 4个组群 ,各组间的同源性为 83 45 %～ 88 6 2 %。除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外 ,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的 ,基本上可按其地理分布分为东。

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。

狂犬病毒街毒抗原的快速检测

本实验采用抗狂大病毒糖蛋白及核蛋白单抗包被、以抗狂犬病毒核蛋白单抗酶结合物作抗体夹心法（SEIA），检测21份接种了可疑狂犬病街毒的小鼠脑组织悬液，并与小鼠颅内接种法（MIT）比较，结果表明SEIA阳性者17份，滴度范围为1：100～1：1280，这17汾样品经MIT检测亦为阳性，二者符合率达100％，其中2份样品由于病毒量少，要经盲传后，接种小鼠才发病，而用SEIA检测一开始即呈阳性，且随着传代病毒量的增加而SEIA检测滴度也上升。表明SEIA快速、敏感、特异，可用于狂犬病毒病的实验室诊断。

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性

目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。

福建省狂犬病毒街毒株分离鉴定及生物学特性研究

目的分离福建省狂犬病毒街毒株,了解病毒株的生物学特性。方法采集疑似狂犬的脑组织,通过细胞培养和乳鼠脑接种分离狂犬病毒,用直接免疫荧光和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特性进行研究。结果从疑似狂犬的脑组织中分离出狂犬病毒,TCID50的测定结果显示,细胞毒滴度不高,病毒株对BHK-21细胞的适应性不强,LD50的测定结果显示,病毒株为狂犬病毒强毒株。结论从福建省家犬中成功分离到狂犬病毒街毒株,为狂犬病的实验室研究奠定基础。

动物狂犬病病毒街毒株的细胞分离鉴定

目的N2A细胞和BHK-21细胞用于我国动物狂犬病流行街毒株的分离培养。方法狂犬病发病动物脑组织悬液首先脑内接种乳鼠,再采取Nonclon Delta Tube内置盖玻片法从鼠脑中进行病毒分离培养,脑组织悬液接种细胞后96h,利用直接荧光抗体实验检测盖玻片上的病毒感染细胞,判定病毒是否在细胞上增殖;通过测定不同毒株细胞培养上清中的病毒滴度对病毒进行鉴定。结果22份狂犬病病犬、猪和牛的脑组织接种乳鼠后均获得了鼠脑分离毒,将鼠脑毒接种N2A细胞分离获得了22株病毒,接种BHK-21细胞却只分离获得20株病毒。不同病毒株第三代细胞培养上清中的病毒滴度从10-1TCID50/100μL到10-3.6TCID50/100μL。结论N2A细胞对狂犬病病毒街毒株的敏感性高于BHK-21细胞,且不同的病毒株对细胞的适应能力不同。实验分离获得的病毒细胞适应株丰富了我国狂犬病病毒毒种资源,为进一步研究不同病毒分离株的抗原性差异奠定基础。

四株狂犬病街毒的免疫学特性

目的 研究国内分离的4株狂犬病街毒的免疫学特性。方法 采用免疫力试验及中和试验进行抗原性及免疫原性检测。结果4株街毒抗原性存在一定差异，应用aG株疫苗免疫小鼠能保护4株街毒的攻击。结论aG疫苗与4株街毒具有良好的交叉免疫性。

2株狂犬病街毒株全基因组测序及分子进化研究

利用RT-PCR方法,对梅花鹿源(DRV)和鼠源(MRV)2个狂犬病毒街毒株进行全基因组测序,获得2个毒株全基因组序列(GenBank登录号分别为DQ875051和DQ875050)。DRV和MRV毒株全基因组分别与具有代表性的毒株全基因组进行N、P、M、G、L基因的核苷酸和氨基酸同源性比较。不同毒株的全基因组构建的分子系统进化树表明,DRV和MRV分属2个进化支。DRV与Ni-CE、RC-HL和SRV9的亲缘关系最近;MRV与HEP-Flury的亲缘关系最近,并与HHV-RAB-H街毒株同属一个进化支。

狂犬病病毒街毒株对体外培养小鼠海马神经元的损伤作用及其机制

目的:探讨狂犬病病毒街毒株(RV)感染神经细胞的形态学表现,揭示狂犬病病毒致神经功能异常的机制。方法:体内实验,20只C57/BL小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组小鼠脑内接种30μL RV病毒液(10TCID50),对照组小鼠脑内接种等量细胞维持液,利用抗RV抗体检测病毒抗原在小鼠脑组织的分布。体外实验,培养原代海马神经细胞,培养1周后,感染狂犬病病毒,免疫荧光检测感染72、96和120h后病毒的增殖情况。结果:体内实验,狂犬病病毒感染4d后,在海马CA1区锥状神经元胞体和树突中均能检测到狂犬病毒抗原;狂犬病病毒感染7d后,仅在海马CA1区胞体中检测到狂犬病病毒抗原。体外实验,狂犬病RV感染体外培养的原代神经细胞120h后,感染的神经元数量最多,且感染的神经元树突数量减少。结论:狂犬病RV可感染、损伤海马CA1区树突,从而引起小鼠神经功能异常。

两株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与分析

目的对2株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组测序,了解国内狂犬病病毒的流行和变异情况。方法采用乳鼠脑内接种方法分离2株天津地区狂犬病病毒街毒株,RT-PCR扩增病毒DNA覆盖全基因组12个相互重叠的基因片段,PCR产物平端克隆后进行全基因组核苷酸序列测定,然后对其分子变异和进化特点进行分析。进行两分离株的序列相似性、氨基酸同源性、主要功能位点的变异比较和种系发生分析。结果 TJD04和TJD05两株狂犬病病毒全基因组长均为11 924 nts,全基因组序列的组成和结构均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征。病毒基因组由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,氨基酸编码长度未发生变异,5个编码蛋白序列较少发生变化,仅有个别主要功能位点发生变异,且大部分变异均属于无意义沉默突变。多序列相似性比较和种系发生分析显示,两株病毒均属于基因1型,N基因与全基因进化树保持一致,与中国犬源狂犬病病毒BD06同源性最高(99.6%),进化关系近,并具有较为独特的中国地域特点。结论两天津株狂犬病毒可能是自然界中固有的狂犬病病毒街毒株。

3株我国狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的培养及生长特性

目的比较3株来自我国不同地区的狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的生长特性,为建立狂犬病病毒感染模型奠定基础。方法分别通过乳鼠脑内接种和细胞培养法进行连续传代,测定不同代次SXYQ、YN01和GDMMD57株狂犬病病毒街毒株的病毒滴度,计算半数细胞感染量(TCID50)。结果 SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒乳鼠脑内接种传代至10代,病毒滴度随传代次数的增加,呈上升趋势,至第8代后,病毒滴度趋于稳定,分别为105.85、105.63和105.97 TCID50/g,不同毒株间病毒滴度存在差异。SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒接种N2a细胞后,随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性不断增强,病毒滴度呈上升趋势,至第15代后,病毒滴度趋于稳定,不同毒株间病毒滴度存在差异;第20代SXYQ株病毒的滴度在感染后2.5 d达到峰值(106.80 TCID50/ml),YN01和GDMMD57株病毒滴度在感染后3 d达到峰值(均为107.30 TCID50/ml)。结论 3株病毒在细胞和乳鼠脑内经连续传代后均能达到较高滴度,可用于狂犬病病毒感染模型的建立及新型疫苗的研究。

狂犬病弱毒SRV9对街毒暴露小鼠的治疗效果

为评估狂犬病弱毒SRV9对狂犬病街毒暴露小鼠的治疗效果,首先将SRV9通过脑内和肌肉接种3周龄ICR小鼠检测其安全性,然后应用狂犬病街毒接种小鼠,随后在暴露后不同时间用SRV9治疗,研究其保护率。结果显示,SRV9对3周龄ICR小鼠安全,在街毒暴露后1、2、3d,SRV9的保护率分别为70%、60%、30%,而相同暴露时间下单剂量灭活疫苗联合免疫球蛋白的保护率分别是30%、20%、10%。对应用SRV9治疗而成活小鼠的中和抗体检测,发现所有小鼠的抗体水平均达到0.5IU以上,这些数据初步显示活弱毒SRV9具有用于暴露后治疗的潜力。

细胞培养法检测和分离狂犬病街毒的可行性研究

目的研究MNA细胞培养法检测和分离狂犬病街毒的可行性。方法用MNA细胞培养法、荧光抗体实验（FAT）和双抗体夹心ELISA方法分别检测33份狂犬病街毒样品、20份狂犬病毒阴性犬脑样品和4份正常鼠脑样品。结果MNA细胞培养法检测57份待检样品，培养48h的实验结果显示，33份狂犬病街毒样品均为阳性，狂犬病毒阴性犬脑样品和正常鼠脑样品均为阴性，与FAT、双抗体夹心ELISA方法的检测结果完全一致。结论MNA细胞培养法对样品中狂犬病街毒的检测具有较高的灵敏度和特异性，可用于狂犬病街毒的检测和分离。

近期狂犬病病毒街毒株的抗原变异

狂犬病病毒(rabiesvirus,RABV)街毒株与疫苗株之间的基因和/或抗原差异可能会影响狂犬病疫苗的有效性。因此,持续监测狂犬病病毒街毒株糖蛋白(glycoprotein.G)是很重要的。检索并分析公共数据库中所有RABVG序列。利用假病毒系统.我们研究了99个自然发生的突变体对中和性单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)和疫苗诱导抗血清的反应性。

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒（CVS、3aG株）及2株街毒（SX、PB3）的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列。DNAstar软件分析表明：2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100%,2株固定毒株同源性为84.2%,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9%和73.7%;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4%~84.2%,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100%。对糖蛋白信号肽疏水区（-15位到-4位）的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒。

北京1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及分析

本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株（BJ2012ZW株）在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异。试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析。结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9%~99.7%。与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高（99.7%）,进化关系近。G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换。BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。

人用精制Vero细胞狂犬病疫苗的保护性试验

用CTN 1V株生产的精制Vero细胞狂犬病疫苗腹腔免疫小鼠后 ,再用狂犬病毒街毒株SBD0 7脑内和肌肉攻击 ,结果表明稀释 5倍疫苗的保护率分别为 88 9%和 90 % ,且 5倍稀释疫苗的保护效果与原苗相当 ,此研究证明CTN 1V株能用来作为疫苗的生产毒株。

狂犬病流行特点及防治

1狂犬病病原学狂犬病病毒形似子弹,属弹状病毒科,一端圆、另一端扁平,大小约80×160nm,病毒中心为单股负链RNA,外绕以蛋白质衣壳,表面有脂蛋白色膜,包膜上有由糖蛋白G组成的刺突,具有免疫原性,能诱生中和抗体:且具有血凝性,能凝集雏鸡。

数学概念教学的几点建议

义务教育初中《数学教学大纲》对大量概念的要求只是“了解”,而原大纲中多为“理解”。义务教育数式”予以描述的,抛弃了原教材中的“用运算符号把数或表示数的字母连而成的式子,叫做代数式”

2018年福建省首例疑似狂犬病病例的病毒分离鉴定及G基因序列分析

目的对2018年福建省首例疑似狂犬病病例进行病毒分离鉴定及G基因序列分析。方法收集2018年福建晋江送检的疑似狂犬病患者的血液、唾液及脑脊液样本,进行实验室诊断,昆明乳鼠颅内接种唾液及脑脊液样本,酶联免疫法检测狂犬病病毒(rabies virus,RABV)抗原;免疫荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测血液样本中抗RABV中和抗体;提取接种唾液的乳鼠脑悬液RNA,RT-PCR扩增G基因序列,将其与国内外疫苗株、福建省及相邻省分离的街毒株序列构建NJ(Neighbor-Joining)分子系统进化树,并进行同源性分析。结果血液样本中未检出抗RABV中和抗体;经乳鼠颅内接种及RT-PCR法,仅唾液样本检测出RABV,确诊患者为狂犬病病例,新分离的街毒株命名为18FJ01。该毒株G基因开放阅读框全长1575 bp,编码524个氨基酸,属基因Ⅰ型RABV,与山东省CTN-33疫苗株的亲缘关系最近,与国内PV、aG、HEP-Flury及ERA疫苗株亲缘关系相对较远;与福建邻近省份街毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为84.3%~97.8%和92.9%~98.8%,与国内外疫苗株核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为80.1%~93.2%和88.9%~96.9%。结论成功对该病例进行了病毒分离及鉴定,该毒株与CTN-33疫苗株同源性较高。