衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

目的构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能。方法从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测。结果经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确。SDS-PAGE和West-ern印迹结果显示在70kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右。结论经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础。

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白在早期诊断中的应用

【目的】克隆和表达肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)蛋白酶样活性因子(CPAF)免疫优势区基因,评价重组蛋白在早期感染诊断中的应用价值。【方法】挑选并克隆出Cpn CPAF免疫优势区基因,构建原核表达载体,诱导表达并纯化重组蛋白,分析其抗原特异性;间接ELISA法检测Cpn参考血清、临床血清标本中的特异性IgM抗体,以及呼吸道感染患者痰咽拭子中的Cpn抗原;检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)临床阳性血清和泌尿生殖道分泌物。【结果】高效表达和纯化出一相对分子量约51.3kDa的重组蛋白;Westernblot证明其只与人抗Cpn抗血清发生特异性反应;间接ELISA法检测40份CpnIgM参考血清,阴性和阳性结果的一致率均为100%(40/40);与"金标准"方法MIF对照,检测300例临床血清标本中的IgM抗体,符合率为98.3%;与PCR试剂对照,检测120份呼吸道感染患者痰咽拭子中的Cpn抗原,符合率为88.3%;检测Ct阳性血清和泌尿生殖道分泌物,与Ct没有交叉反应。【结论】制备的CPAF免疫优势区基因重组蛋白具有良好的抗原性,在Cpn感染早期诊断中具有较高的利用价值。

衣原体蛋白酶样活性因子的研究进展

衣原体蛋白酶样活性因子是迄今发现的唯一由衣原体合成,并分泌到宿主细胞的蛋白,具有较强的免疫原性并可降解宿主转录因子RFX5和上游刺激因子USF-1,在衣原体致病过程中发挥重要作用。对该因子的研究将有助于进一步了解衣原体的致病机制,寻找更好的诊断方法和防治措施。现对其结构、生物学性质以及在致病过程中的作用作一介绍。

抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子单克隆抗体在冠状动脉硬化患者肺炎衣原体感染诊断中的初步应用

目的制备抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的单克隆抗体,检测冠状动脉硬化患者的外周血单核细胞和冠状动脉瘤斑块中肺炎衣原体特异性抗原。方法以肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白免疫小鼠,与SP2/0细胞融合后,采用间接ELISA和Western blot筛选阳性杂交瘤细胞,经亚克隆建株;小鼠体内诱生腹水法制备单克隆抗体,用硫酸铵沉淀法对腹水中的单克隆抗体进行纯化,测定其亚类和效价;检测肺炎衣原体标准株以鉴定其特异性。建立间接ELISA方法检测冠状动脉硬化患者外周血单核细胞和冠状动脉瘤斑块标本中的肺炎衣原体抗原。结果获得4株稳定分泌抗蛋白酶样活性因子重组蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为3F8、7B9、8C4和11B5,其效价分别为1∶28000、1∶16000、1∶38000和1∶12000;经亚类鉴定,3F8和7B9杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG2b,其它2株均为IgG1。以制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测肺炎衣原体抗原,与经典PCR方法的检测结果比较,检出率具有较高的一致性。结论成功获得了抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的特异性单克隆抗体,能特异地识别天然肺炎衣原体蛋白酶样活性因子抗原,有望应用于冠状动脉硬化患者肺炎衣原体感染的抗原诊断。

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白在早期诊断中的应用方法及效果

目的探讨肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白在早期诊断中的应用方法及效果。方法通过将Cpn CPAF免疫优势区基因进行挑选并克隆,从而有效的完成原核载体的构建;通过完成诱导表达及纯化重组蛋白,分析其抗原特异性。结果整体符合率达97.3%,检测100份的呼吸道感染Cpn抗原,相较PCR试剂方法,符合率达到了87.6%。结论肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白,存在较高的抗原性,在当前临床医学中,针对Cpn感染的患者行早期诊断中,存在较高的临床诊断利用价值。

鹦鹉热嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白的诊断应用研究

目的检测鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，c加）蛋白酶样活性因子（cMamydial protease-likeactivity factor，CPAF）免疫优势区基因在E．coli B121中高效表达的产物在印5感染诊断中的应用，为建立印s感染的快速诊断奠定实验基础。方法利用生物信息学软件筛选出CpsCPAF免疫优势区基因序列（CPAFm，A196～A450），设计特异性引物，PCR扩增目的基因，将其克隆入pGEX6p-2载体后转化E．coliB121，利用IPTG诱导表达重组蛋白，Westernblot鉴定重组蛋白。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立血清学诊断的间接ELISA法；同时用商品ELISA试剂盒与建立的间接ELISA法检测180份可疑Cps感染的病鸭血清标本，将检测结果进一步用Westernblot方法验证。结果构建原核重组质粒pGEX6p-2／Cps CPAFm，表达相对分子质量约为54×10^3的目的蛋白产物。以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法检测Cps参考血清，其阴、阳性符合率均为100％；与肺炎嗜衣原体（C．pneu-moniae，印n）、沙眼衣原体（C．trachomatis，Ct）无交叉反应。对180份可疑病鸭血清标本进行检测，与商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒比较，以Westernblot方法作对照，自建的ELISA法符合率均为100％，Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率为77．5％～95．0％。结论以Cps CPAF免疫优势区（A196～A450）作为诊断抗原，建立血清学诊断的间接ELISA法具有较好的临床诊断价值。

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的表达与临床应用

目的探讨肺炎嗜衣原体(CPN)蛋白酶样活性因子(CPAF)重组蛋白在CPN感染实验室诊断中的应用价值。方法构建CPAF免疫优势区基因重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,分析其抗原特异性;间接ELISA法检测CPN参考血清、临床血清标本中的特异性IgM和IgG抗体,以及沙眼衣原体(Ct)阳性血清。结果高效表达和有效纯化出一相对分子质量(Mr)约为5.13×103的特异性重组蛋白;间接ELISA法测定用其免疫兔血清中的特异性IgG和IgM抗体效价,分别高达1∶16 000和1∶8 000;检测Cpn IgM和IgG参考血清,阴性和阳性结果符合率均为100.0%;与"金标准"方法MIF比较,检测300份呼吸道感染患者抗血清,IgMI、gG符合率分别为98.3%、99.0%;检测Ct阳性参考血清和阳性临床血清标本,无阳性结果。结论表达的CPN CPAF免疫优势区重组蛋白具有良好的抗原性,在CPN感染的实验室诊断中具有较高的应用价值。

流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,对全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针,对反应体系和反应条件进行了优化,对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,该方法的最低检测限为26 copies/μL,灵敏度是普通PCR的10倍;与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;对156份流产羊拭子的基因组进行检测,流产衣原体的检出率为78.21%。研究表明,该方法可以很好地应用于流产衣原体的大规模临床样本检测,为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。

衣原体分泌蛋白的研究进展

衣原体通过其自身产生的分泌蛋白实现与宿主的相互作用,此类蛋白主要包括分泌到包涵体膜上(如包涵体膜蛋白等)、分泌到胞浆中(如CPAF、TARP等)及其他分泌蛋白(SINC)。近年来出现了关于不同类型分泌性蛋白的最新研究成果,本综述主要对这些分泌性蛋白的一些新功能进行了论述。