口蹄疫病毒衣壳蛋自前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

［摘 要］目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT－PCR方法扩增了 CC－1毒株的衣壳蛋白前体 P1基因和蛋白酶 3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在 90％以上。结论 成功地克隆了 FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。

AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达与免疫活性分析

将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的重组病毒感染Sf9细胞,72 h后收获细胞,经Western blotting、间接免疫荧光检测,结果表明P12A基因在昆虫细胞中获得表达,相对分子质量约82 ku,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV阳性血清所识别。免疫荧光检测表明表达蛋白主要集中在细胞膜部分。夹心ELISA检测结果表明一部分表达蛋白分泌至培养基中,而有一部分蛋白仍在细胞中未能分泌。表达蛋白加入等量佐剂乳化后免疫豚鼠,间接ELISA检测结果表明豚鼠免疫后15 d即产生了特异性FMDV抗体。本研究为空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究进行了有益的探索。

红色荧光蛋白遗传标记腺病毒衣壳蛋白pⅨ的实验研究

采用在细菌Bj5183中同源重组的方法成功构建了红色荧光蛋白mCherry标记pⅨ蛋白的腺病毒质粒载体.将PacⅠ线性化的腺病毒质粒载体转染HEK293细胞7～10d后获得病毒裂解液,然后将其在体外进一步扩增并经CsCl密度梯度离心纯化后获得mCherry标记腺病毒pⅨ蛋白的病毒颗粒.在采用荧光显微镜检测荧光标记的病毒颗粒之后,将其加入A549细胞中,并在不同时间点追踪观察荧光标记的病毒颗粒在细胞内的定位.结果表明,在荧光显微镜下观察到病毒颗粒的红色荧光;在病毒与细胞孵育过程中,随着荧光标记病毒与A549细胞孵育时间的延长,病毒颗粒逐渐向细胞核周围聚集.

PC12细胞缺氧培养后DNA损伤和修复相关基因表达的研究

目的:探讨PC12细胞缺氧后细胞凋亡与DNA损伤和修复的关系,进一步阐明缺氧导致PC12细胞凋亡的机制。方法:采用TUNEL法,结合应用流式细胞术观察PC12细胞缺氧培养不同时间点细胞凋亡现象,以及DNA损伤修复相关基因表达的改变。结果:在缺氧0.5h时,开始出现凋亡细胞,此时P53、P21waf1/cip1蛋白表达也开始增高,GADD45蛋白表达达到高峰(P<0.01)。至缺氧1h凋亡细胞达高峰,此时P53、P21蛋白表达最高(P<0.05),而GADD45表达则明显下降(P<0.05)。至缺氧6—12h,则以坏死为主,此时以上的基因表达均减弱。结论:PC12细胞缺氧早期(0.5—1h),主要出现凋亡为主的细胞死亡,伴随着DNA损伤相关基因表达的动态改变,提示缺氧后PC12细胞凋亡部分是由于DNA损伤严重,损伤不能及时修复所致。

皮质酮快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶(英文)

实验旨在研究糖皮质激素快速、非基因组作用的细胞内信号传导机制。Western分析研究结果表明 ,皮质酮可快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶 (mitogen activatedproteinkinase ,MAPK) ,时间、浓度曲线均为钟形 ,最大激活为 10 -9mol/L和 15min。糖皮质激素受体阻断剂RU38486不能阻断此作用 ,而小牛血清白蛋白耦联的皮质酮也能快速激活p38。受体酪氨酸激酶阻断剂genistein对此作用无影响 ,表明此快速作用不涉及受体酪氨酸激酶活性。此作用能被蛋白激酶C (proteinkinaseC ,PKC)激动剂PMA模拟 ,而被PKC阻断剂G 6 976所阻断。结果表明 ,皮质酮可能通过推测的膜受体以PKC依赖的方式快速激活p38MAPK。

人源P2Y12基因生物信息学分析

目的:采用生物信息学方法对人源P2Y12基因结构特征进行分析。方法:利用DNAstar、ProtParam、SOPMA、SignalP 4.1、MEGA等5个生物信息学平台,研究人源P2Y12基因和蛋白序列,及其理化性质、二级结构、跨膜结构、信号肽、疏水性、磷酸化和羰基化位点及B细胞抗原表位,并且对其蛋白作用功能和亲缘性进行分析。结果:人P2Y12基因编码区长1029 bp,编码342个氨基酸。人P2Y12蛋白分子式为C 1836 H 2868 N 450 O 476 S 18,分子量为39438.78 u,理化性质稳定,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,含7个跨膜结构,无信号肽,有33个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,存在6个B细胞抗原表位。通过String数据库得到蛋白相关功能和通路,发现P2Y12蛋白在G蛋白偶联相关受体、cAMP信号调节、血小板活化等信号通路中发挥着重要作用,是血小板相关生物过程的重要部分。同源性分析和进化树显示黑猩猩和猕猴与人源P2Y12蛋白相似性最高。结论:利用生物信息学方法对人源P2Y12基因及其蛋白进行研究,为血栓、血小板出血性疾病8(BDPLT8)等疾病的研究和相关药物研发应用提供参考。

氯化钴对PC12细胞的凋亡作用

目的 确定氯化钴(CoCl2 )对PC12细胞的影响。方法 构建CoCl2 诱导的PC12细胞模型,检测CoCl2 对PC12细胞的毒性作用;将Caspases的抑制基因p3 5转染PC12细胞得到可稳定表达p3 5基因的细胞株PC12 p3 5 ,检测p3 5对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用;检测Caspases特异性多肽抑制剂Z VAD FMK对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用。结果 分别以10 0、3 0 0、5 0 0、70 0和10 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h或以5 0 0 μmol LCoCl2 分别诱导PC12细胞12、2 4、3 6、48和60h后,PC12细胞存活率均明显下降(P <0 0 1) ,并与CoCl2 诱导的时间和浓度呈正相关;细胞亚显微结构检测,流式细胞分析和DNA片段化结果也表明5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h可使PC12细胞出现明显凋亡特征。构建可稳定表达Caspase蛋白酶抑制基因p3 5的PC12细胞株,或分别加入5 0和10 0 μmol LCaspases多肽抑制剂Z VAD FMK预处理PC12细胞1h后,以5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h ,形态学观察结果,细胞存活率检测和流式细胞分析均表明p3 5基因和Z VAD FMK均可有效地抑制CoCl2 诱导的PC12细胞凋亡(P <0 0 1)。结论 CoCl2 可诱导PC12细胞凋亡。

非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素P450 1A1基因及表达变化的意义

目的研究非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素P4501A1基因和表达变化及其意义。方法雄性Wistar大鼠40只,随机分为两组,正常对照组8只,高脂饮食组2、4、8、12各8只,紫外分光光度计法检测P4501A1活性(7乙氧异恶唑0脱乙基酶,EROD);免疫组织化学和Westernblot方法测定肝细胞色素P4501A1表达变化,逆转录聚合酶链反应测定肝细胞色素P4501A1mRNA表达变化。结果脂肪肝2、4、8和12周EROD活性分别为325.07±59.68、345.25±49.28、468.95±55.28和548.68±43.25nmol·mg-1·min-1,与正常对照组260.42±35.32nmol·mg-1·min-1比较明显增高(P<0.01),肝细胞色素P4501A1基因及蛋白表达随着脂肪肝程度的加重明显增强。结论非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素P4501A1基因和表达变化与脂肪肝引起的肝脏损害程度密切相关。

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的:克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法:从人胎脑组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增DOC-1的CDS序列,再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化E.coliBL21,用IPTG诱导表达,GlutathioneSepharose4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致,测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带,经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论:成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体,表达并纯化出GST-p12重组蛋白,为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。

乳头瘤病毒L1衣壳蛋白及p16INK4A基因在子宫颈病变中的表达及其相关性

目的研究乳头瘤病毒衣壳蛋白（HPVL1）及p16INK4A基因在子宫颈病变患者中的表达与相关性。方法采用免疫组织化学Max-Vision法检测210例HPV阳性液基细胞学标本及组织中HPVL1蛋白及p16INK4A的表达。结果在各级液基细胞学标本中，HPVL1蛋白阳性率各组比较差异有统计学意义（χ2=70．50、P〈0．005），其中低度鳞状上皮内病变（LSIL）组最高[68％（34／50）]；p16INK4A表达阳性率随着病变级别的增高逐渐增高（13％、28％、52％、100％、100％），在子宫颈癌（SCC）组最高[100％（30／30）1。HPVL1＋p16INK4A率在LSIL组中最高[32％（16／50）]；HPVL1-p16INK4A率在SCC组最高[100％（30／30）]。在各级别病理组织中，HPVL1蛋白表达阳性率不同，差异有统计学意义（χ2=54．37、P〈0．005），其中，CINI级中最高[60．4％（32／53）]；p16删表达阳性率随着病变级别的增高逐渐增高，在子宫颈癌组最高[100％（28／28）]。HPVL1-p16INK4A在CINI级中最高[45．3％（24／53）]；HPVL1-p16INK4A率在子宫颈癌中最高[100％（28／28）]。结论HPVL1蛋白与p16眦“联合检测可以区分不同的子宫颈病变，将有潜在发展与有自愈可能的病例分开，避免漏诊与过度治疗。

CINⅠ的转归及p16INK4a蛋白表达在分流CINⅠ中的临床意义

目的：探讨子宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ的转归，分析影响CINⅠ病变进展的相关因素，并评价p16INK4a蛋白表达在预测CINⅠ病变进展中的价值。方法回顾性分析2010年8月—2013年7月在南京医科大学第一附属医院就诊，初次液基薄层细胞学检查（TCT）结果为≤低度鳞状上皮内病变[LSIL；包括正常、未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）和LSIL]且高危型HPV阳性，并经阴道镜下子宫颈活检组织病理诊断为CINⅠ的患者104例，随访1年观察病变的转归，同时对患者年龄、初次TCT结果、高危型HPV DNA载量、子宫颈脱落细胞中HPV L1壳蛋白及子宫颈组织中p16INK4a蛋白表达情况与CINⅠ病变进展的关系行单因素及多因素分析。结果（1）104例CINⅠ患者中，初次检查TCT结果正常者15例、ASCUS 78例、LSIL 11例；1年后随访时复查：TCT结果正常且高危型HPV阴性者52例，高危型HPV阳性和（或）TCT结果≥正常但经阴道镜检查评估并行子宫颈活检组织病理检查诊断为正常者30例、CINⅠ10例、CINⅡ5例、CINⅢ7例。78.8%（82/104）的患者病变消退；9.6%（10/104）的患者病变持续；11.5%（12/104）的患者病变进展，其中4.8%（5/104）病变进展为CINⅡ，6.7%（7/104）进展为CINⅢ，无一例进展为子宫颈浸润癌。（2）104例CINⅠ患者中，行p16INK4a蛋白检测者88例，其中30例（34%，30/88）p16INK4a蛋白呈阳性表达，58例（66%，58/88）p16INK4a蛋白呈阴性表达；行免疫细胞化学HPV L1壳蛋白检测者94例，其中49例（52%，49/94）HPV L1壳蛋白阳性表达，45例（48%，45/94）HPV L1壳蛋白阴性表达。（3）单因素分析显示，患者年龄、高危型HPV DNA载量、初次TCT结果、HPV L1壳蛋白表达与CINⅠ病变进展无明显相关关系（P〉0.05），而p16INK4a蛋白阳性表达与CINⅠ病变进展明显相关（P〈0.05）。多因素分析显示，p16INK4a蛋白阳性表达是影响CINⅠ病变进展的危险因素（OR=5.1，95%CI为1.162～22.387，P=0.031）。（4）30例p16INK4a蛋白阳性表达的CINⅠ患者中8例（27%，8/30）病变进展，58例p16INK4a蛋白阴性表达者中4例（7%，4/58）病变进展，两者比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。p16INK4a蛋白阳性表达预测CINⅠ病变进展的敏感度为75%，特异度为71%，阳性预测值27%，阴性预测值93%。结论高危型HPV阳性且TCT结果≤LSIL的CINⅠ患者1年内病变进展率较低，无子宫颈浸润癌发生。p16INK4a蛋白阳性是影响CINⅠ病变进展的危险因素，对于预测CINⅠ病变进展有一定的价值，可用于分流CINⅠ，筛查出高危人群进行重点随访。