鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质互作蛋白质基因荧光定量PCR检测方法的建立

为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)的致病机理,本试验建立检测鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质(NP)的互作蛋白质(PKCI)基因荧光定量PCR方法。针对PKCI基因设计特异性引物,经PCR扩增目的基因构建重组质粒p MD18-T-PKCI,将其作为阳性标准品构建荧光定量PCR标准曲线,并对建立的荧光定量PCR方法进行重复性、特异性和敏感性试验。结果显示:标准曲线的线性关系为Y=-3.31x+42.00,相关系数为-1.00,扩增效率为100%,熔解曲线仅出现单特异峰,对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒、鸭肝炎病毒均未检测到荧光信号。表明本试验建立的方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。

腺病毒载体衣壳蛋白质的遗传修饰

腺病毒载体是最早用于基因治疗研究的病毒载体之一,也是目前肿瘤基因治疗中最为常见的病毒载体之一,其主要通过靶细胞表面的天然柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)感染宿主细胞。由于大多数肿瘤细胞表面该受体表达水平较低,降低了腺病毒载体对靶细胞的感染效率,从而制约了腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用。因此,如何提高腺病毒载体对靶细胞的感染效率是腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的关键。目前对腺病毒载体衣壳蛋白质(capsid protein)的遗传修饰是提高其对宿主细胞感染效率的主要途径。本文将对这一领域的主要研究进展作一综述,为该方面的研究提供有用的信息。

以蛋白质衣壳为载体的纳米反应器研究进展

生物纳米材料因其易制备和较高的生物利用度而在工业、医学和环境领域的应用中备受关注。在生物纳米材料中,由若干等价蛋白质亚基组成的具有对称性结构的蛋白质衣壳被看做最有潜力的生物大分子,可作为载体用于封装酶等。蛋白质衣壳封装酶的系统不仅可以保护酶不易被降解,甚至可以改变酶的性质,前者对工业化使用酶提供可能,而对后者还缺乏一定的研究,这篇综述针对这一领域总结了过去的实验研究,以期得到更多的知识,为利用这一体系提供帮助。

黄瓜花叶病毒衣壳蛋白存在于被其侵染的烟草叶绿体中

用原生质体法制备出高纯度的完整叶绿体经SDS-PAGE电泳,银染后,发现黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的烟草病叶叶绿体蛋白质图谱和健叶叶绿体相比,多出一条染色较弱的迁移率与CMV衣壳蛋白质相同的带,经Western转移,用CMV游离衣壳蛋白亚基抗血清进行斑点酶联(Immunoblot)检测,证明这条带就是CMV衣壳蛋白质。健康叶绿体中加入去掉叶绿体的病叶汁液而制备出的叶绿体中无CMV衣壳蛋白质,说明这不是在叶绿体提纯过程中得到的假象,即衣壳蛋白质存在于被CMV侵染的完整叶片叶绿体中。这个结果否认了以往报道的CMV衣壳蛋白质不存在于烟草叶绿体中的结论。另外还发现,叶绿体中的衣壳蛋白质浓度与叶片症状严重程度呈正相关。

人乳头瘤病毒L1壳蛋白在筛查宫颈鳞状上皮内病变中的应用

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)L1壳蛋白筛查HPV阳性妇女宫颈脱落细胞中宫颈鳞状上皮内病变的应用价值。方法:选取2012年5月至2014年12月就诊于温州市人民医院的妇女212例,收集宫颈脱落细胞并行HPV L1壳蛋白检测、HPV DNA分型、TCT(液基细胞学)及阴道镜下活检,比较HPV阳性妇女的宫颈脱落细胞中HPV L1壳蛋白的表达情况。结果:212例细胞学标本中HPV L1壳蛋白阳性率为33.9%,其中未见上皮内病变/恶性细胞组(NILM)、无明确诊断意义的鳞状上皮细胞病变组(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变组(LSIL)、不能排除高度鳞状上皮内病变组(ASC-H)、高度鳞状上皮内病变组(HSIL)中阳性率分别为47.1%、35.1%、54.2%、29.2%、16.1%,各组比较差异有统计学意义(P<0.05);两两比较,HSIL组与LSIL组和NILM组比较,差异均有统计学意义(P均<0.005);进行数据合并后,LSIL/ASCUS组与ASC-H/HSIL组比较差异有统计学意义(P=0.001)。178例宫颈细胞学异常患者中,宫颈低级别病变和宫颈高级别病变的HPV L1壳蛋白阳性率比较,在ASCUS组(P=0.000)、LSIL组(P=0.004)中均有差异,在ASC-H组(P=0.127)、HSIL组(P=0.515)中均无差异。HPV 16/18感染患者的HPV L1壳缺失同宫颈高级别病变有更紧密的关系(P=0.003)。结论:子宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白检测在HPV阳性妇女的子宫颈病变筛查中具有一定的价值,可能成为一种合适的分流方法。

猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析

近期报道在美国多个州的养猪场发现了一种新型的猪圆环病毒3型毒株(porcine circovirus 3,PCV3)。为了确定PCV3是否已经在我国南方部分省份的猪场中广泛存在,并对目前PCV2疫苗是否对PCV3感染具有交叉保护作用作出科学预测,笔者对我国南方几个省份疑似猪皮炎肾病综合征的病猪组织样品进行PCV3巢式PCR检测及其核衣壳蛋白质(capsid protein,Cap)结构的PyMol和抗原表位服务器在线模拟分析。结果首次在这些病料中检测到PCV3的存在,部分病料表现为PCV2和PCV3共感染的特性。对其Cap结构及抗原性分析发现,PCV2和PCV3表现出很大的差异。因此,推测PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性,新的疫苗研究和开发,对于将来控制PCV3流行是必要的。

豚鼠结膜炎衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp3的克隆、表达和鉴定

目的获得豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）噬菌体~CPGl衣壳蛋白Vp3基因及其蛋白。方法提取φCPG1及其核酸，PCR扩增Vp3基因，双酶切后将其定位插入原核表达载体pET30a（＋）中，构建重组表达质粒，转化人大肠埃希菌BL-21，并酶切分析、PCR扩增及测序鉴定，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western印迹鉴定，胶回收纯化。结果获得的Vp3基因片段经测序，长度为447bp，检索确认其序列与GenBank一致。对重组质粒进行诱导表达，SDS-PAGE和Western印迹均显示获得相对分子质量约25000的GPIC噬菌体φCPC1衣壳蛋白Vp3，并得到了纯化蛋白。结论成功表达了噬菌体φCPG1衣壳蛋白Vp3，为进一步研究其作用机制和临床应用奠定基础。

轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备

目的真核重组表达轮状病毒（rotavirus，RV）SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体（IgY）。方法将SA11标准株在MA104细胞中增殖，收集病毒液。从病毒液中提取RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978bp的编码基因，将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。将重组体亚克隆到分泌表达载体pPICZαB中，再将重组体转化人大肠杆菌rop10中，用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中，进行测序。转染成功的菌落再用甲醇诱导表达，亲和层析法纯化重组蛋白抗原，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和蛋白免疫印迹（Western blotting）鉴定，用重组蛋白免疫罗曼母鸡，收集鸡蛋，Western blotting鉴定、纯化IgY。结果细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带，成功构建了含pPICZαB—SAllVP7的毕赤酵母X-35，毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化。毕赤酵母X-33表达的SA11VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40200相符。从鸡蛋中提取的鸡的IgV验证为抗Vfy7的抗体。纯度可达到95％，1个鸡蛋能产10．2mg的IgY。结论抗重组RVSA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础。

心脏基因工程研究:柯萨奇B2病毒云南分离株VP1基因的分子特征

目的:探讨CVB2云南分离株编码主要中和抗原的衣壳蛋白VP1基因的分子特征,以期为中国CVB2感染致病的分子基础、基因疫苗的研制和心脏基因工程实施提供参考依据。方法:采用逆转录PCR技术扩增CVB2云南分离株VP1基因,经分子克隆获得pMD18-T-CVB2VP1并测序,应用生物信息学进行其序列、同源性分析、预测蛋白质二级结构,并建立进化树。结果:CVB2云南分离株VP1基因全长约846bp,无起始密码及终止密码,与Ohio-1株(GenBank登录号:AF081312)核苷酸、氨基酸序列同源性最高为98%。BC环的βB区与βC区之间缺失6个腺嘌呤,其编码2个构成无规卷曲结构的赖氨酸。CVB的共同抗原表位区中RIYFKP-KHVKA高度保守,为云南分离株及其他参考毒株的共同序列,变异主要在CVB2云南株的251～252位,W→Y,V→I。结论:CVB2云南分离株与Ohio-1株同源性最高,亲缘关系最近,以主要中和抗原表位区存在缬氨酸缺失,CVB共同抗原表位区存在具有规律性的变异及保守序列等为其主要分子特征。

真核表达东方马脑炎病毒衣壳蛋白Capsid抑制IFNγ应答基因转录

目的克隆东方马脑炎病毒(EEEV)衣壳蛋白(Capsid)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并初步研究其对干扰素(IFN)应答基因表达的影响。方法构建包含EEEV capsid基因的真核表达载体pcDNA3-Flag-capsid,以威格拉斯脂质体转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测其表达情况;应用定量PCR比较IFN效应基因Gbp1,Gbp2和Isg15在pcDNA3-Flag-capsid和空载体转染细胞中mRNA表达差异。结果构建了EEEV Capsid真核表达质粒,并且该质粒能够在293细胞中有效表达,同时定量PCR结果表明,与空载体转染对照组相比,外源导入EEEV Capsid抑制IFN应答基因Gbp1,Gbp2和Isg15的转录。结论真核表达EEEVCapsid抑制细胞内IFN应答基因的表达,为研究EEEV致病机制奠定基础。

编码人疱疹病毒8型小衣壳蛋白开放阅读框65的原核表达及应用

目的构建人疱疹病毒8型(HHV8)小衣壳蛋白 ORF65编码基因的原核表达载体,并进行原核表达。方法提取 BCBL-1细胞(HHV8阳性而 EBV 阴性)DNA,PCR 技术扩增 HHV8ORF65基因,目的基因与原核表达载体 pThioHis A 连接后,转化宿主菌 Escherichia coli BL21,异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,经带有6个组氨酸标签的亲和层析柱纯化获得重组抗原。重组蛋白电泳后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,与 HHV8阳性血清进行免疫印迹反应。对相关患者进行检测,并与美国 Biotrin 公司生产的 HHV8 IgM 和 HHV8 IgG 抗体间接荧光抗体试验(IFA)检测试剂盒和德国 Qiagen 公司 ELISA 检测试剂盒进行比较。结果 DNA 序列分析表明目的基因序列与HHV8标准毒株相应序列完全一致,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳可观察到相对分子质量为31 500的融合蛋白的表达,免疫印迹反应显示重组抗原具有较高的特异性。基因工程抗原的各项技术指标与 Biotrin 公司和 Qiagen 公司检测试剂盒有较好的符合率,对临床标本的检测表明该试剂盒简单、实用、结果稳定可靠。结论 HHV8重组抗原具有较好的抗原性,进一步完善后可用于 HHV8抗体的检测。

人乳头瘤病毒衣壳蛋白Ll的相关研究

人乳头瘤病毒（HPV）是引起尖锐湿疣等上皮乳头瘤样增生性疾病的主要病原。HPV衣壳蛋白L1，由于其结构特征及精确的抗原特性，在黏附宿主细胞、识别病毒受体、协助病毒DNA的入胞转运中均发挥重要作用，在HPV感染的临床评估和HPV疫苗的研究中日益受到关注。该文对HPV衣壳蛋白Ll的结构和功能及其相关的应用进行了综述。

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1对豚鼠结膜炎衣原体及E型沙眼衣原体的抑制作用

目的探讨豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）噬菌体衣壳蛋白Vp1对GPIC及E型沙眼衣原体的抑制作用，为沙眼衣原体感染的治疗提供新的思路。方法用Vp1—pET30a（＋）重组质粒菌表达Vp1蛋白，Western印迹法鉴定蛋白，透析袋纯化蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将GPIC、E型沙眼衣原体分别与Vp1蛋白、％s甘氨酸溶液、s蛋白及培养液室温孵育3h，衣原体培养过程中分别加入相同浓度的上述液体，72h或48h后，免疫荧光计数包涵体数。结果GPIC在Vp1蛋白组、Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组培养72h，包涵体计数分别为5．0±1．5、24±1．2、25±1．7及25±1．5，各组包涵体数比较，差异有统计学意义（F=476．632，P〈0．05）。Vp1蛋白组GPIC包涵体数显著低于Tris甘氨酸溶液组、s蛋白组及培养液组（P〈0．05），而后3组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。与阴性对照组（培养液组）相比，Vp1蛋白对GPIC的抑制率为（80．2±3．99）％。此外，Vp1蛋白对E型沙眼衣原体的抑制率为（77．2±1．79）％，t检验示Vp1对GPIC的作用与对E型沙眼衣原体的作用差异无统计学意义（t=2．057，P〉0．05）。结论Vp1蛋白可明显抑制GPIC的感染，同时对E型沙眼衣原体有相似的抑制作用。

药物治疗340例宫颈乳头瘤病毒感染的临床观察

目的探讨药物治疗在宫颈人乳头瘤病毒L1(HPVL1)壳蛋白检测阴性治疗中的价值。方法采用杂交捕获二代(HC2)技术,将2009年9月至2011年1月在郑州大学第二附属医院妇科门诊确诊的宫颈高危型人乳头瘤病毒(hr-HPV)感染经HPVL1壳蛋白检测阴性的患者随机分成观察组和治疗组。对观察组不采取任何治疗,对治疗组用药物(辛复宁和保妇康栓)治疗3个疗程后停药。两组患者8个月后,复查hr-HPV和液基薄层细胞学(TCT)。结果治疗组hr-HPV转阴率为80.0%,观察组转阴率为15.3%。治疗组TCT结果未发现异常病例,观察组发现慢性宫颈炎伴上皮内可见控空细胞1例,宫颈上皮内瘤变1级(CIN1)2例。结论药物治疗HPVL1壳蛋白阴性患者有一定作用。

芜菁花叶病毒(广州油菜株)生化性质的研究

我们对芜菁花叶病毒广州油菜株(TuMV—G.Z)进行了生化性质的研究。结果表明,纯化的病毒外壳蛋白经10％SDS-聚丙烯胺酰胶电泳出,现一个组份,其分子量为1.4×10~4d;氨基酸组份分析表明,TuMV—G.Z外壳蛋白亚基由约107个氨基酸残基组成,其中包括1个色氨酸和5个酩氨酸;DNS—C1末端法测其N端,结果显示为苏氨酸,且其氨基是游离的。

Interactions of the HSV-1 UL25 Capsid Protein with Cellular Microtubule-associated Protein

An interaction between the HSV-1 UL25 capsid protein and cellular microtubule-associated protein was found using a yeast two-hybrid screen and β-D-galactosidase activity assays. Immunofluorescence microscopy of the UL25 protein demonstrated its co-localization with cellular microtubule-associated protein in the plasma membrane. Further investigations with deletion mutants suggest that UL25 is likely to have a function in the nucleus.

Host Cell Protein C9orf9 Promotes Viral Proliferation via Interaction with HSV-1 UL25 Protein

In light of the scarcity of reports on the interaction between HSV-1 nucleocapsid protein UL25 and its host cell proteins,the purpose of this study is to use yeast two-hybrid screening to search for cellular proteins that can interact with the UL25 protein.C9orf69,a protein of unknown function was identified.The interaction between the two proteins under physiological conditions was also confirmed by biological experiments including co-localization by fluorescence and immunoprecipitation.A preliminary study of the function of C9orf69 showed that it promotes viral proliferation.Further studies showed that C9orf69 did not influence viral multiplication efficiency by transcriptional regulation of viral genes,but indirectly promoted proliferation via interaction with UL25.

子宫颈液基细胞学检查异常的涂片中人乳头状瘤病毒L1蛋白的表达及其意义

目的探讨人乳头状瘤病毒（HPV）L1蛋白在宫颈液基细胞学检查异常涂片中的表达及其意义。方法选择2006年9月-2008年9月间，在中日友好医院就诊的宫颈液基细胞学检查诊断为≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS），且其第2代杂交捕获试验（HC-Ⅱ）检测HPVDNA结果均为阳性，同时有组织病理学诊断的患者共274例。其中，宫颈液基细胞学检查诊断为ASCUS105例、低度鳞状上皮内病变（LSIL）119例、不除外高度病变的不典型鳞状上皮细胞（ASC—H）9例、高度鳞状上皮内病变（HSIL）36例、宫颈鳞癌5例；组织病理学检查（作为金标准）诊断为炎症96例、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ85例、CINⅡ55例、CINⅢ32例、宫颈鳞癌6例。对此274例患者的宫颈涂片，采用全反应抗体的免疫细胞化学染色进行HPVL1蛋白的检测，分析其对宫颈病变进展的预测价值。结果274例患者中，组织病理学检查诊断为炎症的组织中HPVL1蛋白阳性表达率为69．8％（67／96），CINI为83．5％（71／85），CINⅡ为41．8％（23／55），CINⅡ为3．1％（1／32），宫颈鳞癌为0（0／6），除CINⅢ与宫颈鳞癌比较，差异无统计学意义（P〉0．05）外，其他不同病变间比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；细胞学检查诊断为LSIL的细胞中HPVL1蛋白阳性表达率（75．6％，90／119）最高，其次为ASCUS细胞（63．8％，67／105）和HSIL＋宫颈鳞癌细胞（9．8％，4／41），3者间比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。71例未经治疗的ASCUS、LSIL患者中，55例HPVL1蛋白阳性表达者中无一例疾病进展，16例HPVL1蛋白阴性表达者疾病进展的发生率为19％（3／16），两者比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HPVL1蛋白在宫颈液基细胞学检查异常涂片中的表达情况可以帮助了解宫颈的病变程度，预测宫颈病变的发展趋势，尤其对细胞学检查诊断为ASCUS和LSIL的患者可协助指导临床处理。