人源化基因修饰猪红细胞与人血清免疫相容性的体外研究

目的 探讨野生型(WT)、四基因修饰(TKO/hCD55)和六基因修饰(TKO/hCD55/hCD46/hTBM)猪红细胞与人血清的免疫相容性和免疫差异。方法 收集20名不同血型志愿者的血液,将WT、TKO/hCD55和TKO/hCD55/hCD46/hTBM猪红细胞、ABO-相容(ABO-C)及ABO-不相容(ABO-I)人红细胞分别暴露于不同血型人血清中,检测血凝集、抗原抗体结合(IgG、IgM)水平和补体依赖细胞毒性,评估2种基因修饰猪红细胞与人血清的免疫相容性。结果 ABO-C组未出现明显凝集;WT组和ABO-I组凝集水平高于TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.001)。WT组猪红细胞裂解水平高于ABO-C组、TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组;ABO-I组猪红细胞裂解水平高于TKO/hCD55组、TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.01)。TKO/hCD55组猪红细胞IgM和IgG结合水平均低于WT组和ABO-I组;TKO/hCD55/hCD46/hTBM组猪红细胞IgG和IgM结合水平低于WT组,IgG低于ABO-I组(均为P<0.05)。结论基因修饰猪红细胞的免疫相容性优于野生型猪,并接近于ABO-C,人源化猪红细胞在血资源奇缺时可考虑作为血液来源。

靶向人c-Met蛋白单链抗体的制备及其对肺腺癌A549细胞的杀伤作用

目的制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用。方法将scFv基因插入至p Fuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋白纯化系统纯化;将纯化的Met-scFv进行功能性检测:ELISA检测Met-scFv亲和力;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色检测Met-scFv识别并结合肺腺癌细胞的特性;CCK-8法检测Met-scFv对细胞增殖的影响;通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测Met-scFv对靶细胞A549细胞的毒性影响。结果 ELISA结果提示,Met-scFv与c-Met呈量效关系;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色实验结果提示,与对照组相比,Met-scFv组信号呈阳性,提示Met-scFv与A549细胞特异性结合;Met-scFv抑制A549细胞增殖并产生细胞毒性,且毒性大小与Met-scFv剂量呈正相关。结论制备出靶向c-Met蛋白的Met-scFv,并可在体外识别并介导杀伤A549细胞。

ILY重组蛋白增强利妥昔单抗杀伤骨髓瘤ARH-77细胞的实验研究

目的通过体外实验观察CD59抑制物ILY重组蛋白增强利妥昔单抗(Rituximab)对多发性骨髓瘤ARH-77细胞的补体依赖性细胞毒性效应(CDC效应),探讨联合应用该蛋白治疗多发性骨髓瘤的可行性。方法 FACS分析法侦测ARH-77细胞系的CD20和CD59抗原表达。Alarma blue及Typan blue法观察联合应用ILY重组蛋白及利妥昔单抗对骨髓瘤ARH-77细胞的CDC效应。结果 ARH-77细胞呈现高的CD20及CD59抗原表达;联合应用ILY重组蛋白,能增强利妥昔单抗对ARH-77细胞的CDC效应,逆转其耐药性。结论 ILY重组蛋白可有效地增强利妥昔单抗对多发性骨髓瘤细胞的杀伤效应,有望成为一种新的单克隆抗体治疗肿瘤的辅助药物。

重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)检测方法,并对其进行验证。方法将系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体加入已接种表达CD52抗原的人淋巴瘤靶细胞中,再加入人血浆冻干补体后,采用ATP显色法定量检测靶细胞的活细胞数目。对试验条件进行优化,并对方法进行专属性、准确性、精密度、线性验证。结果重组人源化抗CD52单克隆抗体在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。方法经过优化后,确定人淋巴瘤RAMOS细胞为靶细胞,抗体稀释初浓度为120μg/m L,稀释倍数为1∶1.4。不同浓度的无关抗体均对靶细胞无细胞毒性,方法专属性良好。理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样测定的相对CDC活性分别为(51.33±4.36)%、(75.80±6.31)%、(97.7±7.45)%、(133.27±10.7)%和(158.77±14.13)%,回收率均在80%~120%范围内,相对CDC活性和回收率的RSD均小于10%,方法准确性良好。将100%相对CDC活性试样重复测定6次,6次测定的相对CDC活性为(101.18±8.90)%,RSD小于10%,样品重复性良好。3个不同日期中同一实验员分别检测5个理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样的相对CDC活性的RSD均在10%以内,时间精密度良好。同一日期中2名不同实验员分别检测5个理论CDC活性为50%、75%、100%、125%、150%的试样的相对CDC活性的RSD均在10%以内,人员精密度良好。线性方程为y=1.065 6 x-4.026,r2=0.983 7,线性良好。结论成功建立了重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC检测方法,该方法具有良好的专属性、准确性、重复性、中间精密度和线性,可作为重组人源化抗CD52单克隆抗体CDC活性的常规检测方法。

血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞杀伤Raji细胞作用的影响

目的体外检测血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用的影响。方法通过巢式反转录聚合酶链反应（nest，PCR）检测NK细胞上FcγRⅢa（CD1oa）基因型；流式细胞术检测加入血清抗体前后NK细胞上FcγRⅢa的表达；DIO-PI双荧光染色法检测添加血清补体及抗体后NK细胞对Raji细胞的杀伤效应强度。结果添加血清补体组杀伤率较未添加组明显增强，而添加血清抗体组杀伤率较未添加组明显减弱，在FcγRⅢa-158V／V组内，添加血清补体组、添加血清抗体组与未添加组细胞毒性指数分别为（94．25±1．79、）％、（59．79±0．66）％和（69．05±2．38）％，三组之间两两比较均P〈0．05；在FcγRⅢa-158V／F组内，添加血清补体组、添加血清抗体组与未添加组细胞毒性指数分别为（66．71±5．57）％、（18．13±2．99）％和（39．63±3．86）％，三组之间两两比较均P〈0．05。结论血清补体可增强利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞的杀伤作用。血清抗体会减弱利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞的杀伤作用。使用肿瘤特异性单克隆抗体（MAb）治疗肿瘤患者时，同时输注新鲜冷冻血浆可提高其抗肿瘤疗效；而MAb与静脉注射用免疫球收白（IVIG）同时使用则可能降低其抗肿瘤疗效。

肾移植PRA检测及其临床意义

目的 :探讨酶联免疫法 (ELISA)和微量补体依赖性细胞毒法 (CDC)检测肾移植受者群体反应性抗体(PRA)的优缺点。方法 :将肾脏病患者首次移植术后 1个月血清 40份和首次移植肾失功恢复血透的患者血清 2 2份 ,分别以ELISA和CDC作PRA检测。结果 :ELISA检测耗时 15 0min ,检测出HLA Ⅰ类抗体阳性 2 9例 ,HLA Ⅱ类抗体阳性 2 0例 ;CDC检测耗时 130min ,检测出HLA Ⅰ类抗体阳性 2 8例 ,无法检测HLA Ⅱ类抗体。其中两种方法检测的 2 8例阳性一致。结论 :ELISA检测群体反应性抗体方法稳定、敏感度高、结果准确、操作简便 ,重复性好 ,值得临床推广应用。

眼肌结合抗体的测定及其致免疫损伤机理的研究

用牛眼肌和猪眼肌抗原建立了检测眼肌结合抗体（ＥＭｂ－Ａｂ）的ＥＬＩＳＡ法。证实甲亢患者血清中存在ＥＭｂ－Ａｂ。通过ＥＭｂ－Ａｂ特异免疫复合物、补体解离免疫复合物活性（ＣＲＡ）、ＥＭｂ－Ａｂ依赖的细胞介导的或补体介导的细胞毒性（ＡＤＣＣ或ＣＭＡＣ）测定以及ＥＭｂ－Ａｂ与眼肌细胞抗原结合的实验观察，表明此种ＥＭｂ－Ａｂ可能在与已受某种因素损伤后的眼肌结合时。

肾移植组织配型及免疫监测技术操作规范(2019版)

为了进一步规范肾移植组织配型及免疫监测技术操作,中华医学会器官移植学分会组织器官移植学专家从组织配型基本技术、配型方法、群体反应性抗体、供体特异性抗体、受者免疫监测等方面,制订本规范。

microRNA-143阻遏乳腺癌细胞免疫抑制的作用及其机制

目的探讨microRNA-143(miR-143)阻遏乳腺癌细胞免疫抑制的作用及其分子机制。方法采用MTT法检测乳腺细胞HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC);在脂质体介导下,将miR-143、miR-143对照物(scramble)和miR-143抑制剂(inhibitor)分别转染MCF-7细胞,将miR-143 scramble和miR-143 inhibitor分别转染HBL-100细胞,采用MTT法检测CDC,RT-PCR法检测细胞中补体调节蛋白CD46基因mRNA的转录水平,Western blot法检测CD46蛋白的表达水平。结果乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT-549的A570值与正常乳腺细胞HBL-100相比,均明显升高(P<0.01);与miR-143 scramble转染的MCF-7细胞的A570值相比,miR-143转染组的A570值明显下降(P<0.001),与miR-143 scramble转染的HBL-100细胞的A570值相比,miR-143 inhibitor转染的HBL-100细胞的A570值明显上升(P<0.001);与HBL-100细胞相比,CD46蛋白在MCF-7、MDA-MB-231和BT-549细胞中表达均上调,且与抑制CDC的作用呈正相关;在HBL-100细胞中过表达miR-143 inhibitor能上调CD46蛋白的表达水平,而不影响CD46基因mRNA的转录水平;在MCF-7细胞中过表达miR-143能明显抑制CD46蛋白的表达水平。结论 CD46在乳腺癌细胞中的上调导致了癌细胞对CDC的抵抗作用,是产生免疫抑制的机制之一;miR-143通过抑制CD46蛋白的表达水平,使细胞对CDC的作用更为敏感,提高了补体系统对乳腺癌细胞的杀伤作用,降低了其免疫抑制能力。

单克隆抗体类药物体外生物学活性检测方法概述

单克隆抗体因其具有特异性、高效性以及低毒副作用的特点而在恶性肿瘤、自身免疫疾病以及器官移植排斥的治疗上占据了非常重要的地位,成为众多药企的研发目标。单克隆抗体类药物的体外生物学活性检测是其质量控制中至关重要的一环。单克隆抗体类药物的生物学活性检测方法主要有细胞增殖抑制法、细胞毒性法、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性法(ADCC)、补体依赖的细胞毒性法(CDC)和报告基因法等几类方法。文章根据单克隆抗体类药物的作用特点分别对靶向肿瘤细胞单抗类药物、靶向细胞因子单抗类药物、靶向免疫细胞或者免疫检查点相关分子单抗类药物及抗体偶联药物和双特异性抗体等其他单抗类药物的体外生物学活性的检测方法进行综述。

GTKO/hCD55基因工程猪到人异种移植CDC技术的探讨

目的探讨和比较人CD55(hCD55)转基因猪外周血单个核细胞(PBMC)表面表达的hCD55对兔补体和人补体依赖的细胞毒(CDC)的抑制效果。方法选择来自同一品系的3头α1, 3-半乳糖转移酶基因敲除猪(GTKO)。其中两头猪转入了hCD55基因。根据三头猪PBMC表面hCD55表达水平, 分为GTKO、hCD55低表达(GTKO/hCD55Low)和hCD55高表达(GTKO/hCD55High)猪。将3头猪的PBMC分别与灭活补体的混合人血清(20例份)孵育后, 流式细胞仪检测兔补体或人补体依赖的细胞毒以及猪PBMC的抗体(IgM和IgG)结合水平。结果 3头猪PBMC与人血清异种抗体的结合无明显差异。兔补体和人补体对GTKO猪PBMC的细胞毒均较高, 分别为98.97%±0.50%和82.73%±3.20%。与GTKO组相比, 低表达hCD55对兔补体依赖的细胞毒无明显抑制作用(97.07%±2.25%比98.9%±0.50%, P=0.2267), 而高表达hCD55对兔补体依赖的细胞毒有轻度的抑制作用(81.70%±5.86%比98.9%±0.50%, P=0.0355)。不同的是, 低表达hCD55对人补体依赖的细胞毒有显著的抑制作用(23.83%±3.53%比82.73%±3.20%, P<0.0001);高表达hCD55对人补体依赖的细胞毒较低表达hCD55有进一步抑制作用(2.79%±0.45%比82.73%±3.20%, P=0.009), 使之达到阴性对照组水平。低表达或高表达hCD55对人补体介导CDC的抑制作用均优于对兔补体介导CDC的抑制作用。结论相较于传统使用兔补体的CDC技术, 使用商品化标准人补体的CDC技术评价GTKO/hCD55基因工程猪细胞表面hCD55对受者补体激活的调节作用具有明显优势。本研究对在异种移植走向临床后, 建立能有效评估hCD55功能的CDC实验体系提供了实验依据。