人补体片段C5a蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性检测

目的:为得到可溶性表达的人补体片段C5a蛋白,并检测其生物学活性。方法:用IPTG对C5a融合蛋白进行诱导表达,表达产物经肠激酶酶切后用Ni2+分离柱纯化得到C5a蛋白,通过对中性粒细胞的趋化作用、呼吸爆发、产生乳铁蛋白等实验检测C5a蛋白的生物学活性。结果:成功获得可溶性表达的C5a融合蛋白,通过肠激酶酶切后得到高纯度的C5a蛋白,C5a蛋白对人中性粒细胞具有明显的趋化作用,能引起人中性粒细胞的呼吸爆发并能诱导人中性粒细胞产生乳铁蛋白。结论:可溶性表达了具有生物学活性的人补体片段C5a蛋白,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。

特发性膜性肾病患者血清补体H因子、补体H因子相关蛋白1和补体片段C5a表达观察

目的观察特发性膜性肾病(IMN)患者血清补体H因子(FH)、补体H因子相关蛋白1(FHR1)及补体片段C5a的表达变化,并探讨其临床意义。方法选择98例IMN的患者为IMN组,23例健康体检者作为健康对照组。采集两组静脉血,ELISA法检测血清FH、FHR1及C5a,分析血清FH、FHR1及C5a表达变化与IMN患者肾脏损伤生化指标间的相关性。结果与对照组比较,IMN组血清FHR1、C5a水平升高(P均<0.05)。与少量蛋白尿IMN患者比较,大量蛋白尿IMN患者血清FHR1水平升高(P<0.05)。IMN患者血清FHR1水平与24 h尿蛋白、Cr和Cys-C均呈正相关(r分别为0.492、0.215、0.371;P均<0.05),与eGFR存在负相关(r=-0.298;P<0.05)。IMN患者血清C5a水平与24 h尿蛋白、Cr和Cys-C肾功能生化指标均呈正相关(r分别为0.366、0.231、0.253;P均<0.05),与eGFR存在负相关(r=-0.376;P<0.05)。IMN患者血清FHR1水平与C5a水平呈正相关(r=0.342;P<0.05)。结论IMN患者血清FHR1、C5a水平升高,且血清FHR1、C5a水平可能与患者病情的发生、发展有关。

补体C5a对三氯乙烯致敏小鼠免疫性肾脏损伤中NGAL和MCP-1表达的影响

目的分析补体片段5a(C5a)信号阻断对三氯乙烯(TCE)致敏小鼠肾脏损伤过程中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响,探讨C5a在TCE致敏小鼠免疫性肾脏损伤过程中的可能作用.方法无特定病原体(SPF)级雌性BALB/c小鼠共50只,随机分为空白对照组(n=5)、溶剂对照组(n=5)、TCE处理组(n=20)、TCE+C5aRA联合处理组(n=20).依次用体积分数为50%和30%TCE溶液处理小鼠,建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型为TCE处理组;溶剂对照组使用除TCE以外的其他试剂处理;空白对照组不做任何处理;TCE+C5aRA联合处理组小鼠在激发前2h腹腔注射0.5 mg/kg C5aRA溶液,其他处理同TCE处理组.于末次激发后24 h根据小鼠皮肤红斑和水肿反应评分结果将小鼠分为致敏阳性组和致敏阴性组.于末次激发后72 h无菌处死动物,分离小鼠肾脏,通过组织病理学染色观察小鼠肾脏结构损伤,分别采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫组化(IHC)的方法检测NGAL和MCP-1 mRNA及蛋白水平的改变.结果TCE处理组和TCE+C5aRA联合处理组小鼠致敏率分别为45.0%(9/20)和40.0%(8/20),空白对照组和溶剂对照组小鼠未见明显皮肤损害.组织病理学染色结果显示,TCE致敏阳性组小鼠可见明显的肾小管扩张,肾小管上皮细胞空泡变性,部分有间质炎细胞浸润;联合处理致敏阳性组小鼠上述病理损伤较轻,未见炎细胞浸润.qRT-PCR结果显示,TCE致敏阳性组小鼠肾脏中NGAL和MCP-1mRNA表达水平均明显高于溶剂对照组和TCE致敏阴性组(P<0.05);联合处理致敏阳性组小鼠肾脏中NGAL和MCP-1mRNA表达水平均明显低于TCE致敏阳性组(P<0.05).IHC结果显示,TCE致敏阳性组小鼠肾脏中NGAL和MCP-1蛋白表达水平均明显高于溶剂对照组和TCE致敏阴性组(P<0.05),联合处理致敏阳性组小鼠肾脏中NGAL和MCP-1蛋白表达水平均明显低于TCE致敏阳性组(P<0.05).结论C5a可能通过影响NGAL和MCP-1的表达参与TCE致敏小鼠肾脏损伤,抑制C5a可能是保护TCE所致的免疫性肾脏损伤的有效手段.

CD88在肝细胞癌中的表达及其与预后的关系

目的检测补体5片段受体(complement component 5a receptor)CD88在肝细胞癌组织中的表达情况,探讨其与肝细胞癌患者临床病理参数的关系及其对预后的临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测171例肝细胞癌组织和癌旁组织中CD88的表达情况,并分析CD88与肝细胞癌临床病理特征及预后的关系。结果 CD88在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(Z=-11.540,P<0.001)。年龄≥50岁(x^2=10.77,P=0.005)、TNM分期II^III(x^2=17.31,P=0.002)、肿瘤直径≥5 cm(x^2=17.65,P<0.001),肿瘤数目≥2个(x^2=14.68,P<0.001)、肿瘤侵犯血管(x^2=11.05,P<0.001)者肝细胞癌组织中CD88表达明显偏高(P<0.05),但患者的性别、术前AFP水平、Hbs Ag状态、有无腹水和术前肝功Child-Pugh分级与CD88表达无明显相关(P均>0.05)。单因素分析显示,术前TNM分期、术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者总生存期相关(P<0.05),术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者无进展生存时间相关(P<0.05)。COX风险模型提示,CD88为影响肝细胞癌总体生存时间和无进展生存时间的独立危险因素。结论 CD88可能参与肝细胞癌的恶性进展,其高表达可能提示肝细胞癌患者预后不良。

髓过氧化物酶抗体相关性血管炎患者外周血中性粒细胞胞内髓过氧化物酶表达及其意义

目的初步探讨髓过氧化物酶(MPO)抗体相关性血管炎(AAV)患者外周血中性粒细胞胞内MPO表达及其临床意义。方法选2018年7月至2021年6月安徽医科大学第一附属医院住院的初诊未治的MPO-AAV患者36例(MPO-AAV组), 另选年龄、性别与MPO-AAV组匹配的健康志愿者36例(健康对照组)。流式细胞术(FCM)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分别检测所有受试者中性粒细胞胞内MPO水平和MPO mRNA表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测所有受试者外周血MPO、补体C5活化片段a(C5a)水平及MPO-AAV组患者MPO-ANCA。采用修订的伯明翰血管炎活动度评分(BVAS-V3)对MPO-AAV组患者的疾病活动度进行评估。结果与健康对照组比, MPO-AAV组中性粒细胞胞内MPO mRNA表达水平、血清MPO和血清补体C5a水平显著升高[MPO mRNA:30.2±11.5 比 1.9±0.6, P<0.001;MPO:(112.0±68.7)IU/L比(87.4±22.9)IU/L, P=0.01;补体C5a:(187.3±90.3)ng/ml比(107.3±31.1)ng/ml, P<0.001], 而中性粒细胞胞内MPO水平显著降低(平均荧光强度1 343.3±723.4比2 868.0±1 136.5, P<0.001)。相关分析结果显示, 中性粒细胞胞内MPO mRNA表达水平与MPO-ANCA阳性、血清MPO水平呈正相关(r=0.537, P=0.001;r=0.358, P=0.032), 多元线性回归分析显示, 中性粒细胞胞内MPO mRNA表达水平与MPO-ANCA阳性呈正相关(β=0.695, P=0.006);中性粒细胞胞内MPO水平与MPO-ANCA阳性、血清MPO、血清补体C5a水平呈负相关(r=-0.335, P=0.046;r=-0.372, P=0.026;r=-0.577, P<0.001), 多元线性回归分析显示, 中性粒细胞胞内MPO水平与血清补体C5a水平呈负相关(β=-0.374, P=0.043);BVAS-V3与中性粒细胞胞内MPO mRNA、MPO-ANCA阳性、血清MPO、血清补体C5a呈正相关(r=0.598, P<0.001;r=0.599, P<0.001;r=0.537, P=0.001;r=0.415, P=0.012), 与中性粒细胞胞内MPO水平呈负相关(r=-0.342, P=0.041), 多元线性回归分析显示, BVAS-V3与中性粒细胞胞内MPO mRNA表达水平呈正相关(β=0.511, P=0.002)。结论 MPO-AAV中性粒细胞胞内MPO的合成和释放活性均显著增强, MPO-ANCA阳性和补体C5a可能分别干预中性粒细胞胞内MPO的合成与释放, 中性粒细胞胞内MPO的合成活性是影响血管炎病情活动度的独立因素。