sCR1-SCR15-18蛋白减轻补体介导的大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的:探讨补体在大鼠大脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤中的作用及重组人可溶性补体受体Ⅰ型SCR15-18蛋白(sCR1-SCR15-18)的保护作用。方法:75只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、I/R组和sCR1-SCR15-18保护组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion MCAO),缺血2h,再灌注24h后,进行神经功能学评分,测定脑梗死体积、大脑皮质髓过氧化物酶(myeloperoxi-dase,MPO)活性,观察大脑皮质区补体C3b沉积和病理改变。结果:缺血/再灌注24h后,sCR1-SCR15-18保护组神经功能学评分,脑梗死体积及脑皮质MPO活性明显低于I/R组(P<0.05);sCR1-SCR15-18保护组缺血脑组织补体C3b沉积明显减少,病理损伤减轻。结论:补体在脑I/R损伤中起一定作用,sCR1-SCR15-18蛋白对大鼠I/R损伤脑具有保护作用。

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。

人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D的构建、表达及生物学活性鉴定

目的构建和表达具有抑制补体生物活性的双功能域人补体受体1型衍生分子CR1-SCR2D。方法基于我室前期工作,将CR1-SCR1-3、人工α螺旋肽段linker、SCR15-17 3个DNA片段依次克隆到改造载体pPIC9k(+)和pPICZαB,构建出表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D;电转化毕赤酵母X-33得到阳性重组子,甲醇诱导目的蛋白CR1-SCR2D表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果;经纯化获得CR1-SCR2D并进行糖基化鉴定后,用CH50和AH50法鉴定目的蛋白在体外抑制补体的生物活性。结果成功构建了目的基因的表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D,基因测序正确;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;经镍柱纯化后得到较纯的CR1-SCR2D,糖基化鉴定证明其存在糖基化;CH50法和AH50法结果显示CR1-SCR2D均有较CR1-SCR1-3和CR1-SCR15-17更好的抑制补体生物学活性。结论成功构建了双功能域人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR2D的分泌表达,该融合蛋白对经典/MBL途径及旁路途径补体激活均具有较好的抑制作用。