草鱼补体C3基因的克隆及在感染大中华鳋草鱼个体的表达分析

利用抑制差减杂交技术 ,构建了草鱼与大中华鳋感染相关的差减文库 ,测序得到一些免疫相关基因 ,其中包含与鲤补体C3高度同源的片段 .根据此片段设计引物 ,采用RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术 ,克隆了草鱼补体C3的cDNA ,其全长5 171bp ,编码 16 77个氨基酸 .与已报道的补体C3一样 ,草鱼补体C3同样具有在功能上比较重要的残基以及保守的硫酯区 .草鱼补体C3与高等脊椎动物鸡、小鼠以及人的C3在氨基酸序列上有着相近的相同率 (37.9%～39.1% ) ,与其他鱼类的比较显示与鲤的相同率最高 ,与鲤的 3个基因型C3 H1,C3 H2 ,C3 S的相同率分别为 80 .5 % ,75 .4 % ,79.2 % .系统发育树也显示了草鱼补体C3与鲤补体C3,尤其是鲤C3 S基因型形成一簇 .Southern杂交显示草鱼补体C3存在多个拷贝 ;虚拟Northern杂交和RT PCR进一步证实所克隆到的补体C3在感染大中华鳋的草鱼中表达量增加 ,表明草鱼补体C3是一个与大中华鳋感染相关的基因 .

鸭补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定

为了提取鸭补体C3d基因,并对其进行克隆鉴定,试验采用微量提取法提取了鸭肝脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出补体C3d基因的cDNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后克隆到pMD18-T载体上,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。结果表明:鸭补体C3d基因序列与原鸡和AA肉鸡的相似性较大,其同源性分别为87.6%和87.5%;而与人、猴、猪、牛、羊、鼠等哺乳动物差异性较大,同源性分别为46.9%、46.9%4、8.7%4、9.1%4、9.1%4、7.5%。其主要变化发生在与CR2受体结合的区域。鸭该区为29个氨基酸,与鸡相同,但比哺乳动物多1个氨基酸,说明补体C3d结构具有种属特异性。

DINH与C3d3融合基因真核表达质粒的构建

为了构建DINH和mC3d基因融合的分泌型真核表达载体，试验将含有INHα（1～32）基因的pMD19-INH构建含有双拷贝INHα（1—32）基因的真核表达载体pcDNA—DPPISS—DINH，然后将鼠源C3d基因引入DINH基因3′端构建了一种基于DINH—C3d3的抑制素基因疫苗pcDNA—DPPIS—DINH—C3d3。酶切及测序结果表明，pcDNA—DPPIS—DINH、pcDNA—DPPIS—DINH—sC3d3-构建正确。

DINH与sC3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建DINH和sC3d3融合分泌型真核表达载体,并在BHK-21细胞中表达。方法:采用RT-PCR技术扩增绵羊补体C3d基因片段,将该片段插入到pMD18-T载体,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA-DPPIS-DINH-mC3d3构建pcDNA-DPPIS-DINH-sC3d3。pcDNA-DPPIS-DINHsC3d3脂质体法转染BHK-21细胞,Western blotting鉴定DINH-sC3d3融合蛋白。结果:酶切及测序结果显示,pcDNA-DPPIS-DINH-sC3d3构建正确;在BHK-21细胞中成功地获得了DINH-sC3d3融合蛋白的高效表达。结论:构建的抑制素基因疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础。