补气活血合剂干预脑缺血再灌注模型大鼠相关因子及自噬蛋白的表达

背景:补气活血合剂治疗气虚痰瘀型缺血性脑卒中有显著的临床疗效,然而其具体起效机制尚不明确。目的:观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及自噬蛋白Beclin1、p62表达的影响。方法:取40只雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补气活血合剂组与自噬抑制剂组,每组10只。模型组、补气活血合剂组与自噬抑制剂组建立大脑缺血再灌注损伤模型,补气活血合剂组大鼠再灌注2 h后灌胃给予补气活血合剂(6.49 g/kg,每天分3次给药),自噬抑制剂组大鼠再灌注2 h后灌胃给予补气活血合剂(6.49 g/kg,每天分3次给药)+腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(灌胃前2 h注射,灌胃第1-3天注射),假手术组、模型组灌胃给予等量生理盐水,连续灌胃给药7 d。末次给药24 h后,进行大鼠神经功能、脑梗死体积、脑组织形态及大脑缺血皮质区血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及自噬蛋白Beclin1、p62表达检测。结果与结论:①Zea-Longa评分结果显示,造模后大鼠神经功能受到严重损伤,补气活血合剂组大鼠神经功能损伤轻于模型组、自噬抑制剂组(P<0.05);②TTC染色结果显示,模型组、补气活血合剂组与自噬抑制剂组大鼠均可见大脑梗死灶,补气活血合剂组大鼠脑梗死体积低于模型组、自噬抑制剂组(P<0.05);③缺血侧脑组织苏木精-伊红染色结果显示,模型组神经细胞间有较大的空隙且排列不整齐,神经细胞出现胞质凝集、核固缩现象;补气活血合剂组和自噬抑制剂组神经细胞间隙减小且排列较规律,存在部分细胞出现胞质凝集、核固缩表现;④免疫组化染色结果显示,血管内皮生长因子多表达在神经元细胞、神经胶质细胞及毛细血管内皮;碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子多表达在神经元细胞、神经胶质细胞,4组间血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子表达比较差异无显著性意义(P>0.05);⑤Western blot检测结果显示,与假手术组相比,模型组Beclin1蛋白表达降低(P<0.05),p62蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,补气活血合剂组Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05);与补气活血合剂组相比,自噬抑制剂Beclin1蛋白表达降低(P<0.05),p62蛋白表达升高(P<0.05);⑥结果表明,补气活血合剂可通过促进自噬来减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响

目的:观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的影响。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补气活血合剂组及补气活血合剂+外泌体抑制剂GW4869组(后简称合剂+GW4869组)各10只,模型组、补气活血合剂组及合剂+GW4869组均采用大脑中动脉线栓法复制大鼠大脑中动脉梗塞模型,假手术组仅给予颈内动脉、颈外动脉及颈总动脉的解剖分离而不进行线栓插入,缺血2h后拔除线栓进行再灌注;补气活血合剂及合剂+GW4869组分别在再灌注2h后开始灌胃补气活血合剂(10mL/kg,3次/日),合剂+GW4869组在每次灌胃前给予外泌体抑制剂GW4869腹腔注射(2.5mg/kg·d),假手术组及模型组给予灌胃等量生理盐水,四组均连续干预7天。7天后,分别记录各组大鼠干预前后的神经功能缺损评分,TTC染色法计算干预后各组大鼠脑梗死体积,HE染色法评估各组大鼠神经组织形态学变化,Western Blot法检测大鼠梗死区组织Nestin、GFAP蛋白及血清外泌体CD63蛋白的表达水平。结果:干预7天后,假手术组未表现出神经功能缺损症状,模型组神经功能缺损评分显著升高(P<0.01),补气活血合剂组神经功能缺损评分较模型组显著降低(P<0.05),应用GW4869后,神经功能缺损评分较补气活血合剂组显著升高(P<0.01)。TTC染色结果显示:假手术组大鼠脑组织成正常红色,未见肉眼苍白梗死灶,模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组均可见右侧大脑苍白梗死灶;与假手术组相比,模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加(P<0.01);与模型组相比,补气活血合剂组的大鼠脑梗死体积比显著降低(P<0.05);与补气活血合剂组相比,合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加(P<0.01)。HE结果显示:假手术组染色均匀,组织完整,神经细胞形状为圆锥状,排列整齐,核大居中,有明显的核仁;模型组脑皮层神经细胞排列不规则,神经元明显肿胀,核仁不明显,出现核固缩、细胞间隙存在不同大小的空泡样改变,出现间质水肿;与模型组相比,补气活血合剂组、合剂+GW4869组神经元坏死减少、组织水肿的形态表现较轻;与合剂+GW4869组相比,补气活血合剂组坏死神经元和脑组织水肿等病理损伤较轻。Western Blot结果显示:与假手术组相比,模型组GFAP、CD63表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著升高(P<0.05);加用GW4869后,补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著下降(P<0.05),Nestin表达仅有与GFAP、CD63相似的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:补气活血合剂可缩小脑梗死体积,提高脑梗死组织中GFAP蛋白的表达,改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度,该作用可能与促进外泌体分泌有关。