补肺益肾组分方Ⅲ组分配伍对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑的干预作用研究

背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是重大慢性疾病,气道重塑是其重要病理机制。补肺益肾方对COPD疗效较好,其有效成分组成的补肺益肾组分方Ⅲ(ECC-BYFⅢ)与之疗效相当,可显著改善COPD模型大鼠气道重塑,但其组分配伍规律尚待揭示。目的基于COPD大鼠模型评价ECC-BYFⅢ及其组分配伍对COPD气道重塑的干预作用。方法将ECC-BYFⅢ组分分成补气、补肾、化痰、活血4类,按数学排列组合的方法将其分成不同的组分配伍组。2018年5—9月进行动物实验。将216只SD大鼠随机分为正常、模型、ECC-BYFⅢ、不同组分配伍及氨茶碱组,共18组,每组12只。第1~8周,采用香烟烟雾暴露联合反复细菌感染的方法制备COPD稳定期大鼠模型(正常组除外);第9~16周,给予相应的药物干预。苏木素-伊红(HE)染色技术观察气道壁及气道平滑肌变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中基质金属蛋白酶12(MMP-12)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及支气管肺泡灌洗液(BALF)中胶原蛋白(COL)-1、COL-3、MMP-12等气道重塑相关指标水平。Region(R)值综合评价各组分配伍对COPD大鼠气道重塑的干预作用。结果与模型组比较,ECC-BYFⅢ及其组分配伍、氨茶碱组大鼠气道壁厚度均降低,ECC-BYFⅢ组、补气化痰组、扶正化痰组、扶正活血组、补气祛邪组、氨茶碱组大鼠平均气道平滑肌细胞数减少(P<0.05)。与模型组比较,ECC-BYFⅢ组、补肾组、补气化痰组、补气活血组、补肾化痰组、补肾活血组血清b FGF水平降低,ECC-BYFⅢ组、扶正组血清MMP-12水平降低,ECC-BYFⅢ及其组分配伍、氨茶碱组BALF MMP-12、BALF COL-1水平均降低,ECC-BYFⅢ组、补肾组、化痰组、活血组、扶正组、补气化痰组、补气活血组、补肾活血组、扶正化痰组、补气祛邪组、补肾祛邪组及氨茶碱组BALF COL-3水平均降低(P<0.05)。对COPD大鼠气道壁厚度、气道平滑肌增生情况、血清及BALF中所有气道重塑相关指标进行R值综合评价结果显示,除化痰、祛邪组分配伍外,ECC-BYFⅢ及其余组分配伍和氨茶碱组均可改善COPD大鼠气道重塑(P<0.05),以补气祛邪、扶正化痰、补气活血组分配伍改善COPD大鼠气道重塑效果较好。结论ECC-BYFⅢ及其组分配伍可不同程度干预COPD大鼠气道重塑,其中以补气祛邪、扶正化痰、补气活血(均含补气类组分:人参皂苷Rh1和黄芪甲苷)组分配伍效果较为显著。

补肺益肾组分方Ⅲ对大鼠实验性肺动脉高压的改善作用

目的:探讨补肺益肾组分方Ⅲ(ECC-BYPⅢ)对烟雾和细菌诱导的大鼠肺动脉高压(PH)的改善作用,初步阐明其作用机制。方法:SPF级SD大鼠随机分为对照组(n=9)和造模组(n=140)。对照组大鼠常规饲养,造模组大鼠给予香烟烟雾和克雷伯杆菌(Kp),制备PH模型。停止造模后,造模大鼠按照肺功能均匀的原则分为模型组(n=10)和低剂量(3.24 mg·kg^(-1)·d^(-1),n=9)、中剂量(6.48 mg·kg^(-1)·d^(-1),n=10)及高剂量(12.96 mg·kg^(-1)·d^(-1),n=10)ECC-BYPⅢ组。给药大鼠按照组别每天分别给予相应剂量的ECC-BYPⅢ灌胃,对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。连续给药4周。第29天检测各组大鼠肺动脉平均压(mPAP)、收缩压(PASP)、舒张压(PADP)和右心肥大指数(RVHI)。取大鼠肺组织,部分采用苏木精-伊红(HE)染色,观察各组大鼠肺组织中肺小动脉周围炎症等病变;部分采用维多利亚蓝染色,测定各组大鼠肺小动脉血管中非肌性血管、部分肌性血管和肌性血管的百分比,肺小动脉管壁厚度占管径的百分比(WT%)及血管腔面积占血管总面积百分比(LA%)。另取大鼠肺组织,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠肺组织中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、内皮素1(ET-1)和前列环素(PGI2)水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠mPAP、PASP和PADP明显升高(P<0.05或P<0.01),RVHI明显增加(P<0.01),肺小动脉周围炎症细胞浸润明显,肺组织中TNF-α和IL-6水平明显升高(P<0.01),肌性血管百分比和肺小动脉WT%明显升高(P<0.01),非肌性血管百分比和LA%明显降低(P<0.01),肺组织中ET-1水平和ET-1/PGI2比值明显升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠mPAP和PADP明显降低(P<0.05);与模型组比较,中和高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠肺小动脉周围炎症细胞浸润明显改善,中和高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠肺组织中TNF-α及IL-6水平、WT%及肌性血管百分比明显降低(P<0.01),LA%明显升高(P<0.01);与模型组比较,中和高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠肺组织中ET-1水平明显降低(P<0.05或P<0.01),高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠ET-1/PGI2比值明显降低(P<0.05)。与低剂量ECC-BYPⅢ组比较,中和高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠WT%和肺组织中ET-1水平明显降低(P<0.05或P<0.01),LA%明显升高(P<0.01);中剂量ECC-BYPⅢ组大鼠肺组织中TNF-α水平,高剂量ECC-BYPⅢ组大鼠肺组织中IL-6水平和ET-1/PGI2比值明显降低(P<0.05)。结论:ECC-BYPⅢ可降低PH,减小肺血管壁厚度,改善管腔狭窄和肺小动脉肌化,改善肺血管重构,其机制可能与减轻肺血管周围炎症反应、改善血管周围收缩血管因子水平/舒张血管因子水平失衡有关。

补肺益肾组分方Ⅱ活性成分优化及组分方Ⅲ的建立

目的:优化治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)的补肺益肾组分方Ⅱ(ECC-BYFⅡ)活性成分,形成ECC-BYFⅢ。方法:建立A549/THP-1细胞共培养炎症模型,分人参提取物及人参皂苷Rb1、Rg3、Rh1不同浓度组,ELISA检测细胞上清液中白介素(IL)-6、IL-1β、IL-8、基质金属蛋白酶(MMP)-9水平,筛选人参提取物药效相当的人参皂苷及成分配比,组成初步确定的ECC-BYFⅢ。将108只SD大鼠随机分为正常组,模型组,氨茶碱组,人参皂苷Rh1高、中、低剂量组,黄芪甲苷高、中、低剂量组,第1—8周采用香烟烟雾暴露联合细菌感染制备COPD稳定期大鼠模型。第9—16周给予药物干预,结束后取材。从肺功能、肺组织病理、炎症反应、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡方面评价药物对COPD大鼠的干预作用,确定ECC-BYFⅢ。结果:人参皂苷Rh1与人参提取物对共培养细胞炎症因子抑制作用相当,可代替人参提取物组成组分确定的ECC-BYFⅢ,该组分方可显著抑制细胞炎症反应。含不同剂量人参皂苷Rh1、黄芪甲苷的ECC-BYFⅢ对COPD大鼠药效指标效应不同,人参皂苷Rh1中剂量效果较好。结论:含人参皂苷Rh1中剂量ECC-BYFⅢ纠正COPD大鼠药效指标效果较好,可代替人参提取物组成ECC-BYFⅢ。

补肺益肾组分方Ⅲ联合针刺对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织胶原和蛋白酶的影响

目的评价补肺益肾组分方Ⅲ、针刺及其联合在不同时间点对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织胶原和蛋白酶的影响。方法将240只SD大鼠随机分为空白组、模型组、氨茶碱组、补肺益肾组分方Ⅲ组(组分方组)、针刺组、补肺益肾组分方Ⅲ联合针刺组(联合组)。1~12周制备COPD大鼠模型,13~20周分别给予相应干预,停止干预后继续观察至28周结束。分别于14、16、20(即治疗2、4、8周)及24、28周(即停止干预4、8周)检测大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量及ColⅠ、ColⅢ蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9、ColⅠ和ColⅢ均升高,TIMP-1降低(P<0.01),并随疾病进程加重。与模型组比较,组分方组第16~24周ColⅠ和ColⅢ降低,16~28周TIMP-1升高,20~28周MMP-2降低(P<0.05,P<0.01);针刺组第16~24周ColⅠ和ColⅢ降低,16~20周TIMP-1升高,仅第20周MMP-2、MMP-9降低(P<0.05,P<0.01);联合组第16~28周ColⅢ降低、TIMP-1升高,16~24周ColⅠ降低,20~28周MMP-2降低(P<0.05,P<0.01)。与茶碱组比较,组分方组第16、24~28周TIMP-1升高,20~24周ColⅢ降低(P<0.05,P<0.01);针刺组第16周TIMP-1升高,第20周MMP-2降低,第16~24周ColⅢ降低(P<0.05,P<0.01);联合组第16~28周TIMP-1升高,16~24周ColⅢ降低,20~24周ColⅠ降低(P<0.05,P<0.01)。与针刺组比较,组分方组、联合组TIMP-1上升(P<0.05);28周联合组TIMP-1上升(P<0.01)。结论补肺益肾组分方Ⅲ、针刺及其联合均可明显改善COPD肺组织蛋白酶和胶原沉积,但各有特点:针刺起效早但作用时间短,补肺益肾组分方Ⅲ及其联合针刺起效早且作用时间长,以联合为优。

补肺益肾组分方对PM2.5诱发慢性阻塞性肺疾病加重模型大鼠上皮-间质转化的影响

目的观察PM2.5及补肺益肾组分方对慢性阻塞性肺疾(COPD)大鼠上皮-间质转化(EMT)的作用,并探讨其作用机制。方法将50只健康SD大鼠随机分为:空白组、COPD组、大气颗粒物(PM2.5)组、补肺益肾组分方组(组分方组)和氨茶碱组,每组10只。除空白组外采用香烟熏吸联合反复克雷伯杆菌感染制备COPD大鼠模型,除空白组和COPD组外以大气实时浓缩PM2.5对其进行全身暴露。自暴露第1天起,组分方组和氨茶碱组分别给予补肺益肾组分方[6.48 mg/(kg·d)]或氨茶碱[54 mg/(kg·d)]灌胃,其余各组给予生理盐水,1次/天,持续8周。检测大鼠最大呼气中期流速(MMEF)和功能残气量(FRC);免疫组化法检测肺组织α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(COLⅢ)表达;Western Blot检测肺组织E-钙黏附蛋白(E-cad)、N-钙黏附蛋白(N-cad)、α-SMA、COLⅠ、Smad家族成员(Smad)4、p-Smad2/3表达;ELISA法检测血清和肺组织匀浆中TGF-β1水平。结果与空白组比较,COPD组MMEF及E-cad蛋白表达降低,FRC、TGF-β1水平及α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、α-SMA、p-Smad3、Smad4蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01);PM2.5组MMEF及E-cad蛋白表达降低,FRC、TGF-β1水平及α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、N-cad、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01)。与COPD组比较,PM2.5组FRC、TGF-β1水平及α-SMA、COLⅠ、COLⅢ表达增加(P<0.05,P<0.01)。与PM2.5组比较,组分方组MMEF及E-cad表达升高,FRC、TGF-β1水平及α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、N-cad、p-Smad2、Smad4蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);氨茶碱组FRC、TGF-β1水平及α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、p-Smad2、Smad4蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论PM2.5暴露促进COPD大鼠肺组织EMT,进一步加重肺功能损伤;补肺益肾组分方可有效防治PM2.5诱导的COPD肺组织EMT加重,其机制可能与调控TGF-β1/Smad通路有关。

基于起效时间和远后效应观察补肺益肾组分方联合针刺干预COPD大鼠的疗效特点

目的:观察补肺益肾组分方、针刺及其联合在不同干预时间对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠的疗效特点。方法:240只SD大鼠随机分为正常组、模型组、氨茶碱组、补肺益肾组分方组(组分方组)、针刺组、补肺益肾组分方联合针刺组(联合组),1—12周卷烟烟雾熏吸联合细菌感染法制备COPD稳定期大鼠模型。13—20周各治疗组分别给予不同干预手段,停止干预后继续观察至第28周,分别于14、16、20、24、28周取材。检测肺功能[用力肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼气容积(FEV0.1)]、肺病理[肺泡平均截距(MLI)、平均肺泡数(MAN)、支气管管壁厚度(Wt)]和肺组织氧化应激相关指标[总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、脂质过氧化物(LPO)],评价不同干预手段对COPD大鼠的疗效特点。结果:肺功能:各干预组第16周升高FVC和FEV0.1(P<0.01),其中,组分方组和氨茶碱组疗效持续至第24周(P<0.05,P<0.01),针刺组至第20周(P<0.05),联合组至第28周且优于组分方组和针刺组(P<0.05,P<0.01)。肺病理:各干预组均可升高MAN,降低MLI和Wt,其中,联合组起效早且持续至第28周(P<0.05,P<0.01)。氧化应激:各治疗组均可升高T-SOD、T-AOC,降低LPO,其中,联合组可持续升高T-SOD、T-AOC至第28周,降低LPO持续至第24周(P<0.05,P<0.01)。结论:各干预方案对COPD大鼠均有良好疗效,其中,组分方组和联合组起效时间早,联合组远后效应最佳。

基于VEGF/PI3K/Akt通路的补肺益肾组分方干预慢性阻塞性肺疾病改善肺血管重构机制研究

目的基于血管内皮生长因子(VEGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路探讨补肺益肾组分方对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺血管重构的影响。方法选取32只SD大鼠随机分为正常组、模型组、补肺益肾组分方组(简称组分方组)和氨茶碱组,每组8只。采用香烟烟雾熏吸联合肺炎克雷伯氏菌反复感染法制备COPD大鼠模型。正常组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃(雄鼠2.0 mL/次,雌鼠1.5 mL/次),补肺益肾组分方组和氨茶碱组分别给予补肺益肾组分方[5.5 mg/(kg·d)]和氨茶碱[54.0 mg/(kg·d)]混悬液灌胃,干预8周后取材。观察大鼠肺功能和肺组织病理变化,免疫荧光和免疫组化法检测细胞分化因子34(CD34)、VEGF、内皮素-1(ET-1)蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测VEGF、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、ET-1 mRNA表达,Western Blot法检测VEGF、VEGFR2、PI3K、Akt、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组潮气量(TV)、呼气峰流速(PEF)、50%呼气流速(EF50)、用力肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼气容积(FEV 0.1)、平均肺泡数(MAN)、管腔面积占血管总面积百分比(LA%)降低,功能残气量(FRC)、肺泡平均截距(MLI)、支气管壁厚度(BWT)、管壁厚度占外径百分比(WT%)、管壁面积占血管总面积百分比(WA%)、VEGF、ET-1、VEGFR2、PI3K、Akt、p-Akt、m TOR蛋白表达及VEGF、VEGFR2、ET-1 mRNA表达升高(P<0.01),肺组织CD34蛋白阳性表达增多。与模型组同期比较,氨茶碱组干预后TV、PEF、EF50、MAN、LA%升高(P<0.05,P<0.01),MLI、WT%、WA%、VEGF、ET-1、VEGFR2、PI3K、m TOR蛋白表达及VEGF、VEGFR2、ET-1 mRNA表达降低(P<0.01),肺组织CD34蛋白阳性表达降低;组分方组干预后TV、PEF、EF50、FEV 0.1、MAN、LA%升高,FRC、MLI、W%、WA%、BWT、VEGF、ET-1、VEGFR2、PI3K、m TOR、p-Akt蛋白表达及VEGF、VEGFR2、ET-1 mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),肺组织CD34蛋白阳性表达降低。与氨茶碱组同期比较,组分方组干预后PEF、EF50升高,MLI、WT%降低(P<0.05,P<0.01)。结论补肺益肾组分方能够改善COPD模型大鼠肺小血管重构,其作用机制可能与调控VEGF/PI3K/Akt通路有关。

补肺益肾组分方联合针刺对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺小血管的影响

目的观察补肺益肾组分方联合针刺不同治疗时期对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺小血管的影响。方法将240只大鼠随机分为空白对照组(空白组)、模型组、补肺益肾组分方组(组分方组)、针刺组、补肺益肾组分方联合针刺组(联合组)和氨茶碱组,每组40只。1~12周采用香烟熏吸联合细菌感染法制备COPD稳定期大鼠模型。13~20周组分方组、针刺组、联合组及氨茶碱组分别给予补肺益肾组分方、针刺、补肺益肾组分方联合针刺和氨茶碱干预,空白组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃,停止干预后继续观察至第28周,分别在第14、16、20、24和28周取材。观察不同治疗时期血管壁厚度占血管外径百分比(WT%)、管壁面积占血管总面积百分比(WA%)及管腔面积占血管总面积百分比(LA%)的变化,检测肺组织中血管内皮生长因子(VEGF)和内皮素-1(ET-1)表达,并采用R值综合评价法对各指标进行综合评价。结果与空白组比较,模型组14~28周WT%、VEGF、ET-1均升高,16~28周WA%升高、LA%降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,氨茶碱组14、24、28周WT%降低,16~24周VEGF降低,16、28周ET-1降低,16、24、28周R综合降低;组分方组14~28周WT%降低,16、20周WA%降低、LA%升高,14~24周VEGF降低,16~28周ET-1降低,R综合第16、24、28周降低;针刺组14~28周WT%、R综合降低,20周WA%降低、LA%升高,14、20周VEGF降低,20、24周ET-1降低;联合组14~28周WT%、VEGF降低,16、20、28周WA%和ET-1降低、LA%升高,16~28周R综合降低(P<0.05,P<0.01)。与针刺组比较,组分方组16周VEGF、ET-1降低,28周R综合降低;联合组16周VEGF降低,ET-1、R综合24周升高,28周降低(P<0.05,P<0.01)。与氨茶碱组比较,组分方组14、20周VEGF降低,20、24周ET-1、R综合降低;针刺组16周VEGF、ET-1升高,14、20周VEGF降低,20、24周ET-1降低,20、28周R综合降低;联合组14、20周VEGF降低,20、24周ET-1、R综合降低(P<0.05,P<0.01)。综合所有时间点显示,与模型组比较,各治疗组R综合均降低(P<0.01);与氨茶碱组比较,组分方、针刺及联合组R综合降低(P<0.05,P<0.01)。结论补肺益肾组分方、针刺及其联合治疗可明显改善COPD肺组织肺血管重构,针刺起效早,组分方及其联合针刺作用时间长,以联合为优。