胃饥饿素对高糖下视网膜微血管内皮细胞氧化应激及铁死亡的抑制作用

目的研究胃饥饿素对高糖下人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)氧化应激及铁死亡的影响。方法将体外培养的HRMEC分为对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组,分别采用常规培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖+10 nmol/L胃饥饿素培养基培养24 h。采用细胞计数试剂盒8检测细胞增生情况;采用流式细胞术检测细胞活性氧簇(ROS)水平;采用试剂盒检测细胞中氧化应激指标还原型谷胱甘肽(GSH)浓度、丙二醛(MDA)浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性及Fe^(2+)浓度;采用透射电子显微镜观察线粒体结构;采用Western blot法检测HRMEC中铁死亡关键分子谷胱甘肽过氧化合物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达。结果对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组细胞增生率分别为(100.62±3.40)%、(63.74±4.25)%和(88.19±4.65)%,ROS荧光强度分别为15512.20±1347.53、46457.00±1072.65和22220.87±1669.20,GSH浓度分别为(68.52±7.61)、(21.45±1.57)和(55.68±5.15)μmol/L,MDA浓度分别为(0.79±0.10)、(2.47±0.27)和(1.08±0.15)μmol/L,SOD活性分别为(111.67±10.32)、(37.75±5.92)和(97.45±9.12)U/ml,Fe^(2+)浓度分别为(3.02±0.30)、(9.45±0.71)和(4.63±0.32)mmol/mgprot。各组间细胞增生率、ROS荧光强度、GSH浓度、MDA浓度、SOD活性及Fe^(2+)浓度总体比较,差异均有统计学意义(F=61.82、414.59、61.28、67.24、61.64,146.14,均P<0.001);与对照组相比,高糖组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性均明显降低,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性明显升高,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组相比,高糖组细胞内线粒体铁死亡现象明显;与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组线粒体状态明显改善。各组间细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=63.94、182.84,均P<0.001);与对照组相比,高糖组和高糖+胃饥饿素组细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组2种蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论胃饥饿素可促进高糖下的HRMEC增生,抑制高糖诱导的氧化应激和铁死亡。

高糖环境下XIST对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨高糖环境下长链非编码RNA X-非活性特异转录本(XIST)对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法:以人视网膜血管内皮细胞为研究对象,设对照组和高糖组,分析高糖对人视网膜血管内皮细胞XIST表达的影响;设对照组、高糖组、高糖+XIST组、高糖+阴性对照组,分析过表达XIST对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响;设对照组、高糖组、高糖+XIST组、高糖+XIST+pcDNA3.1-Wnt1组、高糖+XIST+pcDNA3.1-CON组,分析XIST通过Wnt1/β-catenin通路对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。结果:(1)高糖组XIST相对表达量较对照组低(P<0.05)。(2)与对照组比,高糖组细胞增殖活力低,而凋亡率、Wnt1和β-catenin水平高(P<0.05);与高糖+阴性对照组比,高糖+XIST组增殖活力高,而凋亡率、Wnt1和β-catenin水平低(P<0.05)。(3)与对照组比,高糖组细胞增殖活力低,而凋亡率高(P<0.05);与高糖组比,高糖+XIST组增殖活力高,而凋亡率低(P<0.05);与高糖+XIST+pcDNA3.1-CON组比,高糖+XIST+pcDNA3.1-Wnt1组增殖活力低,而凋亡率高(P<0.05)。结论:XIST通过负调控Wnt1/β-catenin通路抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡。

lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)损伤的影响及其可能的作用机制。方法:采用高糖诱导hRMECs建立细胞损伤模型。高糖(HG)组将hRMECs培养在浓度为25 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基24 h;正常(NG)组将hRMECs培养在浓度为5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基;按照实验设计分别将si-NC、si-SNHG6、si-SNHG6和anti-miR-NC、si-SNHG6和anti-miR-186-5p转染至hRMECs,随后25 mmol/L D-葡萄糖孵育24 h,分别记为HG+si-NC组、HG+si-SNHG6组、HG+si-SNHG6+anti-miR-NC组、HG+si-SNHG6+anti-miR-186-5p组。qRT-PCR法检测lncRNA SNHG6、miR-186-5p的表达量;双荧光素酶报告实验检测lncRNA SNHG6与miR-186-5p的靶向关系;MTT法与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10的水平;采用试剂盒检测SOD的活性和MDA的水平;Western blot检测cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果:HG组与NG组比较lncRNA SNHG6表达升高,miR-186-5p表达降低(均P<0.05);lncRNA SNHG6可靶向结合miR-186-5p。转染si-SNHG6后细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax蛋白水平,IL-1β、TNF-α、IL-8含量以及MDA活性降低(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10含量以及SOD的活性升高(P<0.05)。共转染si-SNHG6和anti-miR-186-5p后,细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax、IL-1β、TNF-α、IL-8以及MDA升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10和SOD降低(P<0.05)。结论:干扰lncRNA SNHG6表达可通过促进miR-186-5p表达而抑制高糖诱导的hRMECs凋亡、炎症反应及氧化应激。

玄参提取物对糖尿病视网膜病变微血管内皮细胞损伤的影响及其作用机制

目的:探讨玄参提取物抑制微小RNA-646(miR-646)改善微血管内皮细胞损伤缓解糖尿病视网膜水肿的影响及其作用机制。方法:根据简单随机化法将人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)细胞分为对照组、模型组(30 mmol/L葡萄糖)、观察组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL玄参提取物组)、模型+Anti-NC(转染Anti-NC+30 mmol/L葡萄糖)、模型+Anti-miR-646(转染Anti-miR-646+30 mmol/L葡萄糖)组;将30只小鼠根据简单随机化法分为对照组、模型组(60 mg/kg的链脲佐菌素)、观察组(60 mg/kg的链脲佐菌素+100 mg/kg-的玄参提取物),每组10只。比较各组细胞增殖,迁移及miR-646、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)表达;比较各组小鼠视网膜组织ICAM-1、CD31表达及视网膜组织水肿情况。结果:细胞实验结果显示,与对照组比较,模型组细胞miR-646、ICAM-1表达显著升高,VEGFA、CD31表达显著下降(均P<0.05);与模型组比较,观察组细胞miR-646、ICAM-1表达显著降低,VEGFA、CD31表达显著升高(均P<0.05);与模型+Anti-NC组比较,模型+Anti-miR-646组细胞增殖率、迁移细胞数及VEGFA表达显著增加,miR-646表达及凋亡率显著降低(均P<0.05)。动物实验结果显示,与对照组比较,模型组小鼠视网膜组织中miR-646、ICAM-1表达显著升高,VEGFA、CD31表达显著下降(均P<0.05),同时小鼠视网膜组织水肿情况加重;与模型组比较,观察组小鼠网膜组织中miR-646、ICAM-1表达显著降低,VEGFA、CD31表达显著升高(均P<0.05),同时小鼠视网膜组织水肿明显得到缓解。结论:玄参提取物可能通过miR-646/VEGFA机制调节HRMEC细胞增殖、迁移和凋亡,改善缓解糖尿病视网膜水肿。

TRPC3对OIR小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞生物学行为的调控作用

目的探讨瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员3(TRPC3)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞(HREC)生物学行为的调控作用。方法选取健康SPF级7日龄C57BL/6小鼠32只,采用随机数字表法分为对照组和OIR组,每组16只,其中对照组不做特殊处理,OIR组小鼠诱导OIR模型。出生后第17天(PN17)采用视网膜铺片免疫荧光染色验证模型构建是否成功。将体外培养HREC分为正常对照组、转染试剂组和si-TRPC3组,其中正常对照组不做特殊处理,转染试剂组和si-TRPC3组分别采用转染试剂和转染试剂+si-TRPC3转染。采用实时荧光定量PCR法检测TRPC3 mRNA相对表达量;采用Western blot法检测TRPC3、转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)和超氧化物歧化酶(SOD)蛋白相对表达量。另将HREC分为正常对照组、血管内皮生长因子(VEGF)组、si-TRPC3组和Pyr3(TRPC3通道抑制剂)组,分别用完全培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基(si-TRPC3转染72 h)和含有20 ng/ml VEGF重组蛋白+1μmol/L Pyr3的培养基培养48 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测HREC增生能力;分别采用细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞横向和纵向迁移能力。结果PN17时OIR组小鼠视网膜出现病理性新生血管团簇强荧光染色。OIR组小鼠视网膜TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量分别为2.057±0.244和1.517±0.290,明显高于对照组的0.983±0.033和0.874±0.052,差异均有统计学意义(t=6.165、3.094,均P<0.05)。si-TRPC3组TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量明显低于正常对照组和转染试剂组,Nrf2和SOD蛋白相对表达量明显高于正常对照组和转染试剂组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CCK-8实验结果显示,VEGF组细胞吸光度(A)值明显高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞A值明显低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,VEGF组细胞横向迁移率高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞横向迁移率低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Transwell实验结果显示,VEGF组染色细胞数明显多于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组染色细胞数明显少于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论OIR模型小鼠视网膜中TRPC3表达水平升高,下调TRPC3可抑制HREC增生和迁移能力,其机制与Nrf2氧化应激通路激活有关。

连翘苷通过调控CTRP3表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响及其机制研究

目的比较不同剂量连翘苷(PHN)对高糖(HG)诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响,并分析其对补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)表达的调控作用及可能的作用机制。方法采用HG培养人视网膜血管内皮细胞并建立细胞损伤模型(HG组)。HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组人视网膜血管内皮细胞分别用1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)PHN处理后进行HG诱导。HG+pcDNA组、HG+pcDNA-CTRP3组分别用pcDNA、pcDNA-CTRP3转染至人视网膜血管内皮细胞后进行HG诱导。HG+PHN-H+sh-NC组、HG+PHN-H+sh-CTRP3组分别用sh-NC、sh-CTRP3转染后,用100μmol·L^(-1)PHN处理HG诱导的人视网膜血管内皮细胞。检测细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot分别检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、CTRP3蛋白表达水平。结果与Con组比较,HG组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均升高,SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白、CTRP3 mRNA及蛋白水平均降低(均为P<0.05)。与HG组比较,HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均降低,且HG+PHN-H组<HG+PHN-M组<HG+PHN-L组(均为P<0.05),SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白、CTRP3 mRNA及蛋白水平均升高,且HG+PHN-H组>HG+PHN-M组>HG+PHN-L组(均为P<0.05)。与HG+pcDNA组比较,HG+pcDNA-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均降低,SOD、GSH-Px、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均升高(均为P<0.05)。与HG+PHN-H+sh-NC组比较,HG+PHN-H+sh-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均升高,SOD水平、GSH-Px水平、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均降低(均为P<0.05)。结论PHN可减轻HG诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤,其作用机制可能与上调CTRP3表达有关。

二十烷二酸通过结合PPARδ介导ANGPTL4表达增多对人视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 研究二十烷二酸(C20DC)对人视网膜内皮细胞(HREC)增殖、迁移能力的影响,并探讨其作用机制。方法 寻找C20DC干预人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞与HREC的最佳工作浓度,分别为30 mg·L^(-1)与25 mg·L^(-1)。将HREC分为C20DC处理组(C20DC干预HREC)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)干预HREC],通过细胞增殖和迁移实验观察C20DC对HREC迁移及增殖能力的影响;采用分子对接方法模拟C20DC与PPARδ的结合能力;将ARPE-19细胞设为C20DC+ARPE-19组(C20DC干预ARPE-19细胞)与DMSO+ARPE-19组(DMSO干预ARPE-19细胞),采用Western blot检测ARPE-19细胞中PPARδ和血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)蛋白,以及HREC中ANGPTL4蛋白表达水平;采用ELISA定量分析ARPE-19细胞与HREC中ANGPTL4蛋白表达水平。结果 与对照组相比,C20DC处理组细胞增殖、迁移能力均显著提高(均为P<0.05),且可与PPARδ结合稳定(结合能为-7.2 kcal·mol^(-1));Western blot检测结果提示,C20DC+ARPE-19组细胞中ANGPTL4蛋白表达量高于DMSO+ARPE-19组,差异有统计学意义(P<0.05),两组PPARδ受体蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);C20DC处理组细胞中ANGPTL4蛋白表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA定量分析检测结果显示,C20DC+ARPE-19组细胞中ANGPTL4表达量高于DMSO+ARPE-19组(P<0.001);C20DC处理组细胞中ANGPTL4的表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 C20DC可结合PPARδ促进ANGPTL4蛋白的表达,导致视网膜相关细胞(HREC与ARPE-19细胞)增殖与迁移能力增强,其作用机制可能与早产儿视网膜病变新生血管生成增多有关。

基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路探讨柚皮素对视网膜微血管内皮细胞的损伤机制研究

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路探讨柚皮素(NAR)对人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的损伤机制。方法 将HRMECs随机分为对照组、高糖(HG)组、HG+NAR组(3 mg/L NAR)、HG+激活剂(AICAR)组(1 mmol/L AICAR)、HG+NAR+AICAR组(3 mg/L NAR+1 mmol/L AICAR);除对照组向培养基中加入5 mmol/L的D-葡萄糖处理外,其他各组均向培养基中加入30 mmol/L的D-葡萄糖处理。采用CCK-8及Transwell分别检测细胞增殖及迁移情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测自噬因子LC3 mRNA、p62 mRNA表达水平;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测AMPK/mTOR通路及自噬相关蛋白表达水平。结果 与对照组相比,HG组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+NAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,但HG+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+NAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+AICAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NAR可减轻HG诱导的HRMECs损伤,其机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的自噬有关。

Gpr124对高糖环境下视网膜微血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成的调控作用

目的研究高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cell,HRMEC)中G蛋白偶联受体124(Gpr124)表达的变化,以及干扰Gpr124对HRMEC的调控作用。方法免疫荧光观察Gpr124在HRMEC中的表达;高糖刺激HRMEC,将细胞分为空白组和高糖组,CCK-8、EdU检测细胞活力与增殖情况;病毒抑制Gpr124表达后,将细胞分为空白对照组、高糖对照组、高糖+shRNA组以及高糖+Gpr124 shRNA组,划痕实验评估细胞迁移,基质凝胶评估细胞小管形成能力。Western blot检测Gpr124、VEGFA、MMP9和β-catenin相对蛋白表达水平。结果相较于空白组,HRMEC在高糖组中显示出显著提升的细胞活力和增殖细胞数(P<0.01)。高糖环境下,Gpr124、VEGFA以及MMP9的表达水平也显著增加(P<0.01)。同时,在各个时间点,高糖对照组的迁移面积以及体外血管形成面积和管径长度均显著高于空白对照组(P<0.01)。然而,在敲低Gpr124的表达后,高糖+Gpr124 shRNA组的HRMEC在迁移和体外血管形成能力上相较于高糖+shRNA组有显著的降低(P<0.01),并且高糖+Gpr124 shRNA组相比于高糖+shRNA组VEGFA、MMP9以及β-catenin蛋白表达减少(P<0.01)。结论Gpr124能够调控高糖环境下HRMEC的增殖、迁移以及管形成能力,并且还可以抑制VEGFA和MMP9的过度表达,这一影响可能是通过调节Wnt/β-catenin经典通路来实现的。

京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究

目的研究京尼平苷(Gen)对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(hRVECs)增殖、迁移及血管形成能力的影响,并探讨其作用机制。方法采用不同浓度(0、1、5、10、20、40、80 mg·L^(-1))Gen干预hRVECs 24 h,CCK-8检测Gen对hRVECs细胞增殖活性的影响。将hRVECs分为对照组,高糖(25 mmol·L^(-1))组,Gen低、中、高浓度(5、10、20 mg·L^(-1))组,贝伐珠单抗(BEV,250μg·L^(-1))组和Gen高浓度+BEV(250μg·L^(-1))组。CCK-8检测细胞增殖活性;划痕实验检测细胞迁移能力;体外成管实验检测细胞成管能力;Western blot检测细胞中血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、可溶性VEGF受体-1(sFlt-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等蛋白表达水平。结果与0 mg·L^(-1)Gen比较,1、5、10、20、40、80 mg·L^(-1)Gen对hRVECs增殖活性的影响差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与对照组比较,高糖组hRVECs增殖活性和迁移能力均显著增强(均为P<0.05),细胞环形管状结构增多,VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均升高(均为P<0.05),sFlt-1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与高糖组比较,Gen各浓度组和BEV组细胞增殖活性和迁移能力均减弱(均为P<0.05),细胞环状结构减少,VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(均为P<0.05),sFlt-1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与Gen高浓度组比较,Gen高浓度+BEV组细胞增殖活性显著减弱(P<0.05),细胞环状结构减少,VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(均为P<0.05),sFlt-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论Gen可抑制高糖诱导的hRVECs增殖、迁移与血管形成,其作用机制可能与调控VEGF/sFlt-1轴平衡有关。

补阳还五汤对高糖培养的人视网膜微血管内皮细胞自噬和血管形成的干预作用

目的探究补阳还五汤(BYHW)对高糖培养的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)自噬影响和血管形成的干预作用。方法将HRCECs随机分为对照组(CG)、模型组(MG)、BYHW组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。除CG组外,其余各组细胞于25 g/L葡萄糖环境中培养建立高糖损伤模型,BYHW组在MG组的基础上加入5 mg/mL的BYHW水提液,3-MA组加入40μM的3-MA,各组细胞均孵育24 h。采用血管形成实验检测HRCECs血管生成情况,划痕实验检测细胞迁移能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot法分别检测细胞中微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)、苄氯素1(Becline-1)的mRNA和蛋白表达水平。结果(1)血管形成:与CG组比较,MG组血管形成数升高(t=7.747,P=0.000);与MG组比较,BYHW、3-MA组血管形成数降低(t_(BYHW)=-6.303,P=0.000;t_(3-MA)=-4.596,P=0.002),差异均有统计学意义。而BYHW、3-MA组血管形成数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)迁移能力:与CG组比较,MG组HRCECs迁移率升高(t=14.035,P=0.000);与MG组比较,BYHW、3-MA组HRCECs迁移率降低(t_(BYHW)=-9.247,t_(3-MA)=-5.358,均P=0.000);与BYHW组比较,3-MA组HRCECs迁移率升高(t=-3.890,P=0.003),差异均有统计学意义。(3)自噬:与CG组比较,MG组LC3 mRNA、蛋白表达水平升高(t_(mRNA)=8.249,t_(蛋白)=14.890,均P=0.000),Beclin-1蛋白表达水平升高(t=7.114,P=0.000);与MG组比较,BYHW、3-MA组的LC3 mRNA和蛋白表达水平均降低(BYHW:t_(mRNA)=-9.298,t_(蛋白)=-11.727,均P=0.000。3-MA:t_(mRNA)=-3.718,P=0.006;t_(蛋白)=-7.511,P=0.000),BYHW组的Beclin-1蛋白表达水平下降(t=-4.115,P=0.003);与BYHW组比较,3-MA组HRCECs的Beclin-1蛋白表达水平升高(t=-2.448,P=0.038),差异均有统计学意义。结论BYHW延缓非增殖期糖尿病视网膜病的发展可能与其调控HRCECs自噬减少血管形成和迁移有关。

不同时期糖尿病视网膜病变患者血管内皮祖细胞及玻璃体内MMP⁃9、VEGF的变化及意义

目的通过观察不同时期糖尿病视网膜病变(DR)患者外周血血管内皮祖细胞(EPCs)及玻璃体内基质金属蛋白酶(MMP⁃9)、血管内皮生长因子(VEGF)中的变化,探讨EPCs与MMP⁃9、VEGF在DR发病机制中的可能作用及意义。方法前瞻性研究。选择2020年1月至2021年12月在我院诊断为视网膜疾病不伴有糖尿病的患者35例35眼为空白对照组(A组),诊断为Ⅱ型糖尿病不伴有视网膜病变的患者37例37眼为单纯对照组(B组),选择同期我院诊断为DR的患者共78例78眼,按照DR诊断标准分为非增生型DR(NPDR,C组)36例和增生型DR(PDR,D组)42例,流式细胞仪测定并比较四组患者外周血中EPCs的数量变化,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定并比较D组及A组患者玻璃体内MMP⁃9、VEGF的蛋白表达水平。结果四组患者EPCs数量差异有统计学意义(P=0.017)。A组、D组患者EPCs数量均显著高于B组、C组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与A组相比,D组患者EPCs数量略有增加,但两组间差异无统计学意义(P>0.05);B组与C组患者EPCs数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。D组患者MMP⁃9、VEGF的蛋白表达水平明显高于A组,差异均有统计学意义(均为P<0.05),B组及C组患者未参与比较。结论糖尿病可引起外周血EPCs数量减少,但EPCs数在PDR时大量增加,并且与之相关的MMP⁃9、VEGF明显高表达,可能提示EPCs通过调节相关因子的表达参与糖尿病视网膜新生血管增殖的发生机制。

基于正交实验设计补阳还五汤水提液对高糖培养视网膜微血管内皮细胞活性影响

目的基于正交实验筛选高糖损伤模型的最佳葡萄糖干预浓度、补阳还五汤水提液(BYHWT)保护高糖诱导视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)损伤的最佳浓度及最佳作用时间。方法CCK8法检测4.5、5、10、15、20、25 mg/mL葡萄糖浓度和0、5、10、15.625、31.25、62.5、125、250 mg/mL BYHWT浓度对HRCECs细胞增殖的影响。采用L9(34)正交实验设计以葡萄糖浓度、BYHWT浓度及孵育时间为影响因素,以OD值为评价指标,优选出高糖损伤模型的最佳葡萄糖干预浓度、BYHWT防护高糖损伤HRCECs的最佳浓度及最佳作用时间。根据正交实验优选出的葡萄糖浓度和BYHWT浓度,将HRCECs细胞分为正常组、模型组(优选葡萄糖浓度)与干预组(优选葡萄糖浓度+优选BYHWT浓度),培养24、48、72 h,每日换液1次,CCK8法测定3组细胞不同时间的OD值。结果①与4.5 mg/mL组比较,25 mg/mL葡萄糖浓度干预HRCECs细胞24、48、72 h后OD值均明显降低(P<0.05),提示该浓度可引起细胞损伤。与0 mg/mL组比较,5 mg/mL BYHWT干预24 h,10、15.625 mg/mL BYHWT干预48、72 h后OD值均明显提高(P<0.05),提示该浓度可促进增殖。②筛选正交实验可知,影响细胞增殖活性的主次因素为孵育时间>葡萄糖浓度>BYHWT浓度,选择25 mg/mL葡萄糖浓度建立高糖损伤模型,选择5 mg/mL BYHWT浓度干预细胞,观察细胞增殖活性,筛选干预时间。③与正常组比较,模型组干预24、48、72 h后OD值明显降低(P<0.05);干预组干预24、48 h后OD值明显升高(P<0.05),干预72 h后明显降低(P<0.05)。与模型组比较,干预组干预24、48、72 h后OD值明显升高(P<0.05)。结论25 mg/mL葡萄糖培养的HRCECs细胞可以作为高糖损伤模型,5 mg/mL BYHWT干预24 h可以用于研究其对高糖诱导HRCECs损伤的保护作用。

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的:明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。方法:通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生毛细血管管腔样结构形成情况。结果:与NG相比,HG细胞模型中miR-519d-3p表达显著减少,而HIF-1α蛋白表达显著增加(均P<0.01)。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组中HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以与HIF-1α3'-非编码区(3'-UTR)中“GCACUUU”序列特异性结合。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著增加,细胞凋亡率显著减少,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著减少,新生毛细血管管腔样结构数量显著减少(均P<0.01)。与miR-519d-3p过表达组比较,miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著减少,细胞凋亡率显著增加,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著增加,新生毛细血管管腔样结构数量显著增加(均P<0.01)。对照组和甘露醇组中上述各指标比较无差异(均P>0.05)。结论:高糖诱导HRMEC模型中miR-519d-3p表达下调,而HIF-1α蛋白表达上调。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p靶向HIF-1α增加细胞增殖并降低细胞凋亡和炎症反应,从而减轻高糖诱导的HRMEC功能障碍并抑制血管生成。

胃饥饿素通过抑制内质网应激减少高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡

目的研究胃饥饿素(ghrelin)对内质网应激及高浓度葡萄糖导致的人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)凋亡的影响。方法将HRMECs细胞分为对照组、高糖组、高糖+ghrelin组和高糖+ghrelin+衣霉素(内质网应激诱导剂)组。对照组细胞不加干预,高糖组采用30 mmol/L葡萄糖构建细胞损伤模型,高糖+ghrelin组采用30 mmol/L葡萄糖和10 nmol/L ghrelin处理细胞,高糖+ghrelin+衣霉素组采用30 mmol/L葡萄糖、10 nmol/L ghrelin和10μmol/L衣霉素联合处理细胞,所有细胞均培养48 h。采用AnnexinⅤ-FITC/7-AAD试剂盒检测4组细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测对照组、高糖组和高糖+ghrelin组细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及内质网应激蛋白GPR78、IRE1α的表达。结果与对照组比较,高糖组HRMECs细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与高糖组相比,高糖+ghrelin组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与对照组比较,高糖组细胞Bax、GPR78及p-IRE1α的蛋白表达明显增加(均P<0.05),Bcl-2的表达明显降低(P<0.05);与高糖组相比,高糖+ghrelin组细胞Bax、GPR78及p-IRE1α的蛋白表达均明显降低(均P<0.05),Bcl-2的表达明显升高(P<0.05)。与高糖+ghrelin组相比,高糖+ghrelin+衣霉素组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论Ghrelin可以减少高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡,其机制可能与ghrelin抑制激活的内质网应激有关。

miR-1-3p调控ANXA2表达对高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞新生血管生成的影响

目的 探讨微小RNA-1-3p(miR-1-3p)/膜联蛋白A2(ANXA2)分子轴在高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)新生血管生成过程中的作用机制。方法 体外培养HRMECs并采用高糖(HG)处理细胞建立细胞损伤模型。HRMECs分组处理:Con组(含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养)、HG组(25 mmol·L^(-1)D-葡萄糖培养)、HG+miR-NC组(转染miR-NC)、HG+miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、HG+sh-NC组(转染sh-NC)、HG+sh-ANXA2组(转染sh-ANXA2)、HG+miR-1-3p+pcDNA组(转染miR-1-3p mimics+pcDNA)、HG+miR-1-3p+pcDNA-ANXA2组(转染miR-1-3p mimics+pcDNA-ANXA2)。转染48 h后收集细胞,采用25 mmol·L^(-1)的D-葡萄糖培养基培养HRMECs 24 h。采用MTT、Transwell小室实验分别检测细胞活力、迁移细胞数。管腔形成实验检测管腔形成数。双荧光素酶报告实验检测miR-1-3p与ANXA2的靶向关系。Western blot检测VEGF、MMP-2蛋白水平。结果 与Con组比较,HG组miR-1-3p表达水平降低,ANXA2 mRNA及蛋白水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Con组比较,HG组细胞活力升高,迁移细胞数、管腔形成数增多,VEGF、MMP-2蛋白水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+miR-NC组比较,HG+miR-1-3p组细胞活力降低,迁移细胞数、管腔形成数减少,VEGF、MMP-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+sh-NC组比较,HG+sh-ANXA2组细胞活力降低,迁移细胞数、管腔形成数减少,VEGF、MMP-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+miR-1-3p+pcDNA组比较,HG+miR-1-3p+pcDNA-ANXA2组细胞活力升高,迁移细胞数、管腔形成数增多,VEGF、MMP-2蛋白水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 miR-1-3p过表达可通过靶向调控ANXA2表达抑制HRMECs的增殖、迁移及新生血管生成。

补气养阴活络方联合羟苯磺酸钙治疗糖尿病视网膜病变非增殖期气阴两虚夹瘀证疗效及对血清HIF-1、VEGF水平的影响

目的探讨补气养阴活络方联合羟苯磺酸钙治疗糖尿病视网膜病变非增殖期气阴两虚夹瘀证患者的疗效及对血清低氧诱导因子-1(HIF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响。方法选择2020年12月—2021年12月首都医科大学宣武医院收治的86例糖尿病视网膜病变非增殖期患者,随机分成对照组和观察组各43例。对照组患者在降糖治疗基础上联合羟苯磺酸钙口服,观察组在对照组治疗基础上联合补气养阴活络方口服3个月。观察比较2组治疗3个月后中医证候积分、视力水平、视敏度、眼底指标(视网膜循环时间、血管渗漏面积、毛细血管无灌注区面积、微血管瘤个数)、血清HIF-1和VEGF水平、临床疗效、药物不良反应发生情况。结果治疗3个月后,2组视物模糊、目睛干涩、口干咽燥、神疲乏力、肢体麻木评分均明显降低(P均<0.05),且观察组治疗后各项评分均明显低于对照组(P均<0.05);2组视力和视敏度均明显升高(P均<0.05),且观察组治疗后均明显高于对照组(P均<0.05);2组视网膜循环时间、血管渗漏面积、毛细血管无灌注区面积、微血管瘤个数及血清HIF-1、VEGF水平均明显降低(P均<0.05),且观察组治疗后均明显低于对照组(P均<0.05);观察组总有效率为93.0%(40/43),明显高于对照组的76.7%(33/43),差异有统计学意义(P<0.05);2组不良反应均较轻,组间不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论补气养阴活络方联合羟苯磺酸钙治疗糖尿病视网膜病变非增殖期气阴两虚夹瘀证患者疗效更好,可促进视力恢复,机制可能与降低HIF-1、VEGF水平有关。

微RNA-140-5p靶向调节血管内皮生长因子表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响

目的 探讨微RNA(miR)-140-5p靶向调节血管内皮生长因子(VEGF)表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(hRECs)增殖、迁移和管腔形成的影响。方法 将对数生长期hRECs细胞分为正常对照组、高糖组、miR-140-5p组、阴性对照(NC)组、高糖+miR-140-5p组。正常对照组和高糖组细胞不做任何转染,miR-140-5p组和高糖+miR-140-5p组细胞转染miR-140-5p模拟物(miR-140-5p mimics),NC组细胞转染阴性对照模拟物(mimics NC)。高糖组和高糖+miR-140-5p组细胞用含30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基制备高糖模型。应用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组细胞中miR-140-5p表达水平,噻唑蓝法检测各组细胞增殖能力,Transwell法检测各组细胞迁移能力,管腔形成实验检测各组细胞成管能力,Western blot法检测各组细胞中VEGF蛋白的表达。将40只Sprague Dawley大鼠随机分成正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病+NC组、糖尿病+miR-140-5p组,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠腹腔注射65 mg·kg^(-1)链脲佐菌素制备糖尿病模型,正常对照组和糖尿病模型组大鼠尾静脉注射200μL生理盐水,糖尿病+miR-140-5p组大鼠尾静脉注射200μL miR-140-5p,糖尿病+NC组大鼠尾静脉注射200μL mimics NC,每日1次,持续给药7 d;再继续饲养8周,大鼠麻醉后,取视网膜,苏木精-伊红染色观察miR-140-5p对糖尿病模型大鼠视网膜血管生成的影响。结果 高糖组、高糖+miR-140-5p组细胞中miR-140-5p相对表达量显著低于正常对照组,miR-140-5p组细胞中miR-140-5p相对表达量显著高于正常对照组(P<0.01);NC组与正常对照组细胞中miR-140-5p相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-140-5p组、NC组、高糖+miR-140-5p组细胞中miR-140-5p相对表达量显著高于高糖组(P<0.01)。NC组、高糖+miR-140-5p组细胞中miR-140-5p相对表达量显著低于miR-140-5p组(P<0.01)。高糖+miR-140-5p组细胞中miR-140-5p相对表达量显著低于NC组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,高糖组细胞增殖率均显著高于正常对照组(P<0.01),miR-140-5p组、NC组与正常对照组细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24 h时,高糖+miR-140-5p组与正常对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05);培养48、72 h时,高糖+miR-140-5p组细胞增殖率显著高于正常对照组(P<0.01)。培养24、48、72 h时,miR-140-5p组、NC组、高糖+miR-140-5p组细胞增殖率均显著低于高糖组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,NC组与miR-140-5p组细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24 h时,高糖+miR-140-5p组细胞增殖率与miR-140-5p组、NC组比较差异无统计学意义(P>0.05);培养48、72 h时,高糖+miR-140-5p组细胞增殖率显著高于miR-140-5p组和NC组(P<0.01)。高糖组迁移细胞数显著高于正常对照组,miR-140-5p组、NC组迁移细胞数显著低于正常对照组(P<0.01)。高糖+miR-140-5p组与正常对照组迁移细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-140-5p组、NC组、高糖+miR-140-5p组迁移细胞数显著低于高糖组(P<0.01)。NC组、高糖+miR-140-5p组迁移细胞数均显著高于miR-140-5p组(P<0.01)。高糖+miR-140-5p组迁移细胞数显著高于NC组(P<0.01)。高糖组管腔形成数量显著高于正常对照组,miR-140-5p组、NC组细胞管腔形成数量显著低于正常对照组(P<0.01);高糖+miR-140-5p组与正常对照组细胞管腔形成数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-140-5p组、NC组、高糖+miR-140-5p组细胞管腔形成数量均显著低于高糖组(P<0.01)。NC组、高糖+miR-140-5p组细胞管腔形成数量均显著高于miR-140-5p组(P<0.05)。高糖+miR-140-5p组细胞管腔形成数量显著高于NC组(P<0.05)。高糖组、高糖+miR-140-5p组细胞中VEGF蛋白相对表达量显著高于正常对照组,miR-140-5p组细胞中VEGF蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05);NC组与正常对照组细胞中VEGF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-140-5p组、NC组、高糖+miR-140-5p组细胞中VEGF蛋白相对表达量显著低于高糖组(P<0.01)。NC组、高糖+miR-140-5p组细胞中VEGF蛋白相对表达量显著高于miR-140-5p组(P<0.01)。高糖+miR-140-5p组细胞中VEGF蛋白相对表达量显著高于NC组(P<0.05)。正常对照组大鼠靠近视乳头处的视网膜血管整体呈“树状结构”,内极部毛细血管分布较致密,外极部毛细血管分布较疏松,血管壁均匀。糖尿病模型组大鼠视网膜血管的“树状结构”被破坏,毛细血管分布不均匀,毛细血管瘤形成。糖尿病+NC组大鼠视网膜血管损伤与糖尿病模型组相当。糖尿病+miR-140-5p组大鼠视网膜血管的损伤情况有所好转,毛细血管瘤减少。结论 miR-140-5p可以抑制hRECs在高糖条件下的增殖、迁移及成管能力,缓解糖尿病大鼠视网膜血管病变,其作用可能是通过miR-140-5p靶向调控VEGF的表达而实现。

长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因3(MEG3)对糖尿病视网膜病变大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因3(MEG3)对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响。方法取SPF级雄性SD大鼠以及体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC),均随机分为对照组、模型组、LncRNA MEG3过表达组、miR-145-5p agomir组、共转染(LncRNA MEG3过表达质粒+miR-145-5p agomir)组、共转染阴性对照(LncRNA MEG3空载质粒+miR-145-5p agomir阴性对照质粒)组,采用腹腔注射链脲佐菌素建立DR大鼠模型,25 mmol·L^(-1)葡萄糖诱导DR细胞模型。对照组大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液,对照组细胞以正常培养基培养,将大鼠与细胞均分组进行处理,以LncRNA MEG3质粒、miR-145-5p agomir转染处理后,通过伊文思蓝(EB)检测大鼠视网膜血管通透性;TUNEL染色检测大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡率;EdU染色与Hoechst 33258染色分别检测细胞增殖、凋亡情况;依照试剂盒测量大鼠房水中及HRMEC炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量;实时荧光定量PCR实验检测HRMEC及大鼠视网膜组织miR-145-5p表达;蛋白免疫印迹法检测HRMEC及大鼠视网膜组织凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达;双荧光素酶实验验证HRMEC中LncRNA MEG3对miR-145-5p的靶向调节作用。结果LncRNA MEG3过表达组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均低于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);miR-145-5p agomir组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均高于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。LncRNA MEG3过表达组HRMEC增殖率均高于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05),HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均低于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);miR-145-5p agomir组HRMEC增殖率均低于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05),HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均高于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。LncRNA MEG3过表达组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax表达均低于模型组、共转染组,Bcl-2表达均高于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);miR-145-5p agomir组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax表达均高于模型组、共转染组,Bcl-2表达均低于模型组、共转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3过表达质粒组细胞相对荧光素酶活性(0.33±0.05)低于转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3空载质粒组(1.02±0.21),差异有统计学意义(P<0.05)。结论LncRNA MEG3可通过靶向下调miR-145-5p表达,抑制炎症反应,减轻DR大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡,促使HRMEC DR细胞模型存活,改善DR大鼠视网膜血管屏障功能。

Piezo拮抗剂GsMTx4通过激活Yap1/STAT3信号通路促进人视网膜微血管内皮细胞的血管生成

目的探讨Piezo拮抗剂GsMTx4对人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)血管生成能力的影响与机制。方法体外培养hRMECs,随机分为对照组、GsMTx4组、GsMTx4+维替泊芬(VP)组、GsMTx4+Stattic组。GsMTx4组用2.5μmol·L^(-1)的GsMTx4处理细胞24 h,GsMTx4+VP组用GsMTx4联合Yap1的拮抗剂VP(4μmol·L^(-1))处理hRMECs 24 h,GsMTx4+Stattic组则用GsMTx4联合STAT3的拮抗剂Stattic(1.5μmol·L^(-1))处理hRMECs 24 h。CCK-8法检测各组hRMECs的增殖能力。小管形成实验观察各组hRMECs的血管生成能力,记录小管分支数。qRT-PCR和Western blot检测对照组和GsMTx4组hRMECs中Piezo、Yap1、STAT3 mRNA和蛋白的表达水平。使用免疫共沉淀技术检测各组hRMECs中Yap1和STAT3的结合作用。结果与对照组相比,GsMTx4组hRMECs的增殖率和小管分支数均明显增加(均为P<0.05),Piezo蛋白表达下调,而Yap1、STAT3蛋白表达均上调,且Yap1和STAT3的结合作用明显增加(均为P<0.05)。与GsMTx4组相比,GsMTx4+VP组和GsMTx4+Stattic组hRMECs中Yap1和STAT3的蛋白表达均下调,且Yap1和STAT3的结合作用减弱(均为P<0.05)。与GsMTx4组相比,GsMTx4+VP组和GsMTx4+Stattic组hRMECs增殖率和小管分支数均降低(均为P<0.05)。结论Piezo拮抗剂GsMTx4通过激活Yap1/STAT3信号通路促进hRMECs的血管生成。