甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。

新型冠状病毒N蛋白优势表位区段抗原的克隆表达及其诊断价值初步评价

目的:制备高活性新型冠状病毒N蛋白的优势表位区段抗原,并初步评价该抗原在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用价值。方法:利用生物学软件分析N蛋白的B细胞表位分布,选取含有优势表位的抗原区段,然后用分子生物学技术进行克隆表达获得纯化抗原,ELISA初步评价该优势表位区段抗原的检测性能。结果:经过分析筛选确定15~215 aa为优势表位抗原区段,并获得了高效表达抗原。经过Biocore结合实验,确定优势表位区段抗原NP15-215可以与新型冠状病毒肺炎患者血清样本发生特异性抗原抗体反应。基于该抗原建立的IgM和IgG间接ELISA方法,对临床样本的检测灵敏度分别为60.87%、95.65%,特异性分别为90%、100%。NP-IgM检测的AUC值为0.797,NPIgG检测的AUC值为0.998。结论:优势表位区段抗原NP15-215可用于NP抗体检测,利用该抗原建立的NP-IgM/IgG间接ELISA检测方法可以很好地区分新型冠状病毒肺炎患者和健康者。

EB病毒EA优势表位区段抗原的克隆表达及其鼻咽癌诊断价值初步评价

目的:制备高活性EB病毒早期抗原(EA)的优势表位区段抗原,并初步评价该抗原在鼻咽癌诊断中的应用价值。方法:利用生物学软件分析EA抗原的B细胞表位分布,选取含有优势表位的抗原区段,然后利用分子生物学技术进行克隆表达获得纯化抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)初步评价优势表位区段抗原的检测性能。结果:选取了2个优势表位区段抗原并获得了高效表达抗原EA1(61~200 aa)和EA2(291~404 aa),经小样本验证,确定其中EA2具有更高的抗原活性和特异性。放大样本进行检测,基于EA2抗原的IgG和IgA间接ELISA方法,检测灵敏度和特异性分别为90.38%、93.68%和65.38%、95.79%。EA-IgG检测的AUC值为0.972,EA-IgA检测的AUC值为0.893。结论:优势表位区段抗原EA2可用于EA抗体检测,利用该抗原建立的EA-IgG和EA-IgA间接ELISA检测方法可以很好地区分鼻咽癌患者和健康者,EA-IgG比EA-IgA更适于鼻咽癌的鉴别诊断。

狂犬病毒糖蛋白的克隆表达及其在中和抗体检测中的应用

目的:制备基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原,并评价其在疫苗免疫后中和抗体检测中的应用价值。方法:TRIzol法从狂犬病疫苗中提取总RNA,经RT-PCR获得糖蛋白目的基因片段,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,以重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测糖蛋白中和抗体的ELISA方法。结果:获得狂犬病毒糖蛋白优势表位区段抗原,建立了糖蛋白中和抗体ELISA检测方法。该检测方法对59例健康献血员血浆样本检测特异性为98.31%(58/59),接种狂犬疫苗免疫个体血浆样本抗体阳性率为98.95%(94/95)。结论:基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原可用于人接种狂犬疫苗后疫苗免疫效果评价。

埃博拉病毒NP抗原表位区段的克隆和表达

目的分析埃博拉病毒核蛋白（NP）抗原表位,克隆表达埃博拉病毒NP抗原,为免疫学诊断试剂的研究奠定基础。方法采用BioSun生物学软件预测分析埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位区间,采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成基因序列,采用PCR退火合成法合成NP优势密码子抗原基因,并利用载体pBVIL1进行克隆表达。采用间接ELISA技术评价获得NP抗原的特异性。结果确定埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位位于360~739 aa,共设计36条引物,扩增合成1140 bp的NP抗原基因,克隆表达后,融合蛋白相对分子质量为58×10^3,测序结果显示插入的NP基因正确。初步结果显示,NP抗原的特异性为99.24%（130/131）。结论获得埃博拉病毒NP抗原,为进一步研制特异的埃博拉病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。

EB病毒核抗原1优势表位区段抗原的克隆表达及其在鼻咽癌诊断中的应用

目的制备高活性EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen 1, EBNA1)的优势表位区段抗原,并初步评价该抗原在鼻咽癌诊断中的应用价值。方法利用生物学软件BIOSUN分析EBNA1抗原的B细胞表位分布,并从中选取含有优势表位的抗原区段。然后利用分子生物学技术构建含有优势表位区段序列的原核表达质粒并进行表达,获得纯化优势表位抗原,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)初步评价优势表位区段抗原的检测性能。结果成功构建含有优势表位抗原区段序列的原核表达质粒,获得了可溶性表达的EBNA1优势表位区段抗原NA-2(401~641 aa)。通过间接ELISA法对小量样本进行验证,确定NA-2抗原针对EBNA1-IgA抗体具有较高的抗原活性和特异性,较EBNA1-IgG和EBNA1-IgM抗体而言,能够较好地区分鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)和健康对照样本。放大样本量进行检测,基于NA-2抗原的EBNA1-IgA抗体间接ELISA方法检测灵敏度和特异性分别为90.38%和91.58%,EBNA1-IgA抗体检测的AUC值为0.942。结论获得EBNA1优势表位区段抗原NA-2,该抗原是优选的可以用于EBNA1-IgA检测的抗原,利用该抗原所建立的间接ELISA检测方法可以很好地区分鼻咽癌患者和健康对照。