应用噬菌体随机肽库技术筛选戊型肝炎病毒中和表位模拟肽

以识别戊型肝炎病毒 (HEV)构象依赖性中和表位的单克隆抗体 8C11、8H3作为固相筛选分子 ,对噬菌体随机 7肽库进行 4轮筛选后 ,随机挑取单克隆噬菌体进行测序。合成优势 7肽序列基因 ,将其插入HBcAgAA78 83位置之中 ,进行原核表达 ,所获重组蛋白经蛋白印迹实验证实可与相应单抗结合 ,电镜下可见重组蛋白能形成与HBcAg相似的类病毒颗粒。化学合成单抗 8H3筛选出的优势 7肽 ,所获 7肽经生物传感器结合实验证实与单抗8H3结合。这些结果提示用噬菌体 7肽库可以筛选出部分模拟构象性表位的短肽 ,为亚单位疫苗的研制提供了新的思路。

LPS表位模拟肽诱导小鼠保护性免疫的研究

目的鉴定三种LPS模拟位合成肽的抗原性、诱导抗LPS抗体的产生及对细菌攻击的保护性。方法三种LPS模拟位合成肽与载体BSA交联后,ELISA测定其与多种抗LPS单、多克隆抗体的结合活性;合成肽与蓝载体交联物免疫Balb/c小鼠,观察其诱发小鼠体内抗LPS抗体产生的规律及血清抗LPS抗体效价;鉴定针对细菌感染的保护性效应。结果三种合成肽均能与抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗体结合;用合成肽-蓝载体交联物免疫动物可诱发小鼠体内针对两种LPS的抗体反应,并对细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用,以合成肽13a,13b及12W与蓝载体交联物免疫的小鼠在鼠伤寒沙门氏菌攻击后存活时间分别为(6.5±0.77),(9.5±1.38)及(9.3±0.75)d,而PBS/蓝载体对照组存活时间为5d。结论本研究所采用的3种LPS表位模拟肽作为疫苗免疫小鼠能够产生针对细菌攻击的保护性效应,提示此3种表位模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性与可靠性。

从噬菌体环肽库中筛选TNF-α表位模拟肽的研究

目的 :用具有中和活性的抗TNF α单抗 (mAb)J1D9筛选噬菌体环七肽库 ,从中获得可模拟TNF α表位的短肽。方法 :筛选TNF α表位模拟肽 ,并用夹心ELISA法鉴定阳性克隆。结果 :对环七肽库进行 3轮筛选后 ,随机挑选 2 0个噬菌体克隆 ,经ELISA鉴定出 9个阳性克隆。DNA序列分析后 ,推导的氨基酸序列共 3种 :c RRPAQSG c、c NKHNRKI c和c RGMSRKI c。结论 :筛选的环七肽克隆展示肽具有TNF α的抗原性 ,为TNF

日本血吸虫抗原的表位模拟肽筛选及免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫雄虫抗原的表位模拟肽 ,并探讨其诱导小鼠抗日本血吸虫的免疫保护性。 方法 用日本血吸虫可溶性雄虫抗原的IgG对噬菌体随机 1 2肽库进行亲和筛选。 3轮筛选后 ,经Dot-ELISA检测获得阳性噬菌体克隆 ,并用混合特异性噬菌体克隆免疫小鼠及进行抗日本血吸虫免疫保护性分析。 结果 1 8个特异性噬菌体克隆均显示有抗原性 ,其噬菌体混合克隆免疫诱导小鼠产生了特异性抗体 ,以及 31 72 %的减虫率和 51 54%的减卵率 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 0 1 )。 结论 筛选噬菌体肽库获得的日本血吸虫可溶性雄虫抗原的表位模拟肽分子能诱导小鼠产生抗日本血吸虫的保护性免疫。

能与SLE患者血清总IgG抗体识别的噬菌体抗原表位模拟肽的研究

目的:从噬菌体随机肽库中,筛选能与SLE患者血清总IgG抗体特异结合的SLE相关抗原表位的噬菌体模拟肽,并寻找对SLE敏感性和特异性均高的模拟肽。方法:制备SLE患者血清总IgG抗体,以此作为筛选配基,按“吸附-洗脱-扩增”的淘洗过程,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫筛选,随机挑取噬菌体克隆并进行初步鉴定,最后取混合阳性克隆检测SLE患者和正常人血清,分析其与SLE反应的敏感性和特异性。结果:经3轮免疫淘洗后,特异结合的噬菌体富集增加近100倍。随机挑取的11个噬菌体克隆,经鉴定均能与总IgG抗体产生特异性反应,阳性率100%。混合的阳性克隆与SLE反应的敏感性和特异性分别为80%和67%。结论:利用SLE患者血清总IgG抗体筛选噬菌体随机肽库,能获得多种SLE相关抗原表位的噬菌体模拟肽,因其对SLE的敏感性和特异性均高,故有潜在的诊断价值,有望利用该技术开发SLE特异性IgG抗体检测试剂盒。

MUC1模拟表位肽致敏DC对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫微环境的影响

目的:研究黏蛋白1(MUC1)模拟表位肽致敏树突状细胞(DC)对宫颈癌荷瘤小鼠生长和免疫微环境的影响。方法:培养小鼠骨髓细胞,诱导并刺激DC成熟,MUC1模拟表位肽处理构建负载MUC1模拟表位肽的DC。构建稳定表达MUC1的宫颈癌U14细胞株的荷瘤BALB/c小鼠模型,随机分为3组:空白对照组(注射0.2 ml生理盐水)、DC组(注射2×10^(5)个未加MUC1模拟表位肽的DCs)和DC+MUC1组(注射2×10^(5)个负载MUC1模拟表位肽的DCs),免疫1周后进行二次免疫。治疗前和二次免疫1周后测量肿瘤体积;二次免疫1周后取小鼠肿瘤组织称重并计算抑瘤率;取小鼠外周血,流式细胞术检测CD3^(+)T、CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)CD25^(+)Foxp^(3+)Treg水平;ELISA检测小鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF浓度。结果:与治疗前比较,空白对照组、DC组和DC+MUC1组肿瘤体积增大(P<0.05),治疗前各组差异无统计学意义(P>0.05),二次免疫1周后,DC+MUC1组肿瘤体积小于空白对照组和DC组(P<0.05),空白对照组和DC组差异无统计学意义(P>0.05);DC组和DC+MUC1组小鼠抑瘤率均高于空白对照组(P<0.05),DC+MUC1组小鼠抑瘤率高于DC组(P<0.05);DC+MUC1组小鼠外周血CD3^(+)T、CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞水平高于空白对照组和DC组(P<0.05),空白对照组和DC组差异无统计学意义(P>0.05);DC+MUC1组CD4^(+)CD25^(+)Foxp^(3+)Treg和血清IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF水平低于空白对照组和DC组,空白对照组和DC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MUC1模拟表位肽致敏DC可抑制宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤生长,改善肿瘤免疫微环境及细胞因子表达。

交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选

目的 获得具交叉保护性的抗细菌脂多糖 (LPS)多克隆抗体与模拟LPS多表位的噬菌体展示环肽克隆。方法 制备具交叉反应性的兔抗鼠伤寒沙门菌抗血清 ,鉴定抗血清对大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击小鼠的交叉保护性。以亲和纯化的多克隆抗体为靶 ,亲和筛选噬菌体随机环七肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果 兔抗血清能与多种来源的LPS反应 ,对用大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击的小鼠有显著的保护性。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行 3轮筛选 ,随机挑选 4 6个克隆 ,其中 2 0个克隆显示与多抗结合。鼠伤寒沙门菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合 ,所有克隆的IC50 (达到 5 0 %抑制率的LPS浓度 )为 12 5ng ml。挑选其中10个克隆测序并推导氨基酸序列 ,其中 5个克隆具X QFYP X A保守序列 ;3个克隆具LFTFAHY序列 ;2个克隆具YQYYPAA序列 ,所有序列非极性氨基酸含量平均值为 80 .0 %。结论 获得能与多种LPS反应且具交叉保护作用的兔多克隆抗体 ,筛选得到可模拟鼠伤寒沙门菌LPS多表位噬菌体展示环七肽。

人工合成VEGF表位模拟7肽的生物学功能研究

目的: 检测人工合成血管内皮细胞生长因子(VEGF)表位模拟 7肽特异抑制VEGF促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的活性。方法: 通过噬菌体展示技术, 筛选获得了表达模拟肽的阳性噬菌体克隆, 经测序得到VEGF表位模拟肽序列: GWYYDAX。人工合成该短肽, 用体外细胞培养的方法检测其对HUVEC的生长抑制作用。结果: 表位模拟肽GWYYDAX可剂量依赖性抑制VEGF促进HUVEC生长的活性。结论: VEGF表位模拟肽可能模拟了VEGF的部分结构, 竞争结合HUVEC细胞VEGF受体 (KDR), 阻断了VEGF VEGFR的信号传递而抑制细胞生长, 具有潜在的应用前景。

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽细胞免疫应答作用的研究

目的探讨丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽在体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞后的细胞增殖情况。方法选用经7肽皮下多点免疫和脾内直接注射两种免疫途径的免疫小鼠,无菌条件下分离脾淋巴细胞后,实验组分为刺激组与未刺激组,刺激组脾细胞再经7肽刺激,应用单溶液细胞增殖检测法体外检测7肽对免疫小鼠脾淋巴细胞在不同浓度和不同培养时间点增殖的影响。结果体外7肽刺激免疫小鼠脾淋巴细胞后,刺激组的脾淋巴细胞增殖反应与未刺激组比较存在促进作用,与对照组比较出现了明显的增殖反应。结论丙型肝炎病毒高变区1合成肽在体外对免疫小鼠脾淋巴细胞具有一定的促增殖作用。

恶性疟原虫感染的红细胞膜表面蛋白1模拟肽的筛选及鉴定

目的筛选恶性疟原虫感染的红细胞膜表面蛋白1(PfEMP-1)的噬菌体表位模拟肽。方法细胞间粘附分子ICAM-1模拟12肽(KLYLIAEGSVAA)能模拟ICAM-1分子与疟原虫感染红细胞结合的功能,以展示该短肽的噬菌体为靶,采用差减筛选法(subtraction method)对噬菌体环7肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与ICAM-1之间的结合特性。对阳性克隆进行DNA及氨基酸序列分析并与PfEMP-1氨基酸序列进行同源性比较。结果ELISA筛选22个克隆有3个为阳性克隆,氨基酸序列分析显示2个克隆的展示的短肽序列为C-ITAVPVR-C,另1为C-DIMGGYN-C。同源性分析未发现2短肽序列与野生型MC株恶性疟原虫PfEMP-1的氨基酸序列有同源性。但竞争抑制试验显示3个阳性克隆均可与15.2单抗间互相竞争抑制与ICAM-1分子的结合。结论获得2种PfEMP-1噬菌体构象表位模拟肽,两短肽能与ICAM-1分子特异性结合。

滋养层细胞促融合表位肽抗生育作用的初步研究

目的合成多价抗原肽,观察其体液免疫效果,并初步评估其抗生育潜力。方法选择人滋养层细胞促融合表位模拟肽与一种通用辅助T细胞表位(PADRE)作为骨架,合成多价抗原肽(MAP)结构的免疫原,与等量弗氏佐剂混悬后免疫雌性C57BL/6小鼠,观察体液免疫反应的特点及抗血清干扰滋养细胞融合的效果。结果在431A固相自动肽合成仪上成功地合成了MAP多肽,并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95%以上;其在小鼠血清中诱导出的特异性抗体的滴度最高达1:1024,且可以特异识别滋养层细胞相关抗原表位;在1:10稀释的抗血清存在时,forskolin诱导的人绒癌细胞(BeWo)间融合显著减少(P<0·01)。结论由含有人滋养层细胞促融合表位模拟肽、具有特异性氨基酸序列的新抗原所制备的抗血清可识别滋养层细胞相关天然抗原表位,并在小鼠体内激发出较理想的特异性体液免疫,同时,抗血清对BeWo细胞间融合具有一定抑制作用。

体外观察MUC1模拟表位融合肽在DC细胞内呈递的研究

目的研究MUC1模拟表位融合多肽[人免疫缺陷病毒的转录活化因子(TAT)-MUC1模拟表位多肽-内质网靶向肽]在DC细胞内的呈递。方法取小鼠骨髓及脾细胞诱导培养成熟DC细胞,利用荧光显微镜对MUC1模拟表位融合肽在DC细胞内的呈递进行体外观察。结果 MUC1模拟表位融合肽在37℃5%CO_2浓度的暗孵箱内脉冲成熟DC细胞40 min后,DC MUC1组细胞内可检测出强荧光,DC HBcAg组细胞内荧光显示较弱,DC空白组无荧光显示;2 h后,DC MUC1组细胞荧光显示进一步增强,DC HBcAg组与DC空白组细胞内荧光强度无明显变化。结论该模拟表位融合肽能够高效地进入DC胞质并具有DC细胞高选择性靶向。

南极磷虾原肌球蛋白纯化鉴定、理化特性及模拟表位肽预测

对南极磷虾原肌球蛋白(tropomyosin,TM)进行提取纯化与质谱鉴定,并对其热稳定性、pH值稳定性及消化稳定性进行研究,同时利用生物信息学对其进行序列同源性分析、空间结构同源建模及过敏原模拟表位肽识别。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,经蛋白粗提、热除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多步提纯,最终仅在32 kDa附近得到一条清晰条带。利用超高效液相色谱-质谱联用对其进行扫描,经UniProt数据库检索确定该目的蛋白为TM(Euphausia superba),蛋白分子质量32.6 kDa,肽段覆盖率达97%。同源性分析结果表明南极磷虾TM是一种高度保守蛋白,与26种甲壳动物的TM序列同源性在88%~98.2%之间。南极磷虾TM对热、酸碱及胃液消化均具有较强的稳定性,而对肠液消化稳定性较差,易被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解生成低分子质量肽段。通过DNAStar Protean、ANTHEPROT、BepiPred 1.0 server、ABCpred server、Immunomedicine Group 5种生物信息学工具最终预测识别出8条南极磷虾TM模拟表位肽(EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI),并在其空间结构中进行一一映射。本研究为南极磷虾TM模拟表位肽的精准预测识别及其相关低致敏性产品的开发提供了科学依据。

麻痹性贝类毒素GTX2,3模拟表位的初步研究

目的:利用噬菌体展示随机肽库筛选可模拟麻痹性贝类毒素GTX2,3抗原表位的噬菌体,初步鉴定人工合成的GTX2,3抗原表位肽的特异性。方法:以抗麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体(mAb)为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫亲和筛选,以夹心ELISA方法鉴定噬菌体克隆,竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的特异性。对阳性克隆进行DNA测序并推导噬菌体所展示的氨基酸序列。竞争ELISA鉴定模拟GTX2,3表位的合成肽的特异性。结果:经过3轮筛选获得20株能与靶分子高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。序列分析表明DXLXPP为保守序列(X为任意氨基酸)。竞争ELISA检测表明,麻痹性贝类毒素GTX2,3可抑制阳性噬菌体克隆phage2与抗GTX2,3mAb结合。根据阳性序列合成的短肽可以抑制phage2与抗GTX2,3mAb的结合(IC50=13μg/mL)。结论:通过噬菌体肽库筛选技术,成功地获得麻痹性贝类毒素GTX2,3的模拟表位,并初步证实以此为基础合成的短肽能够准确和特异的模拟GTX2,3的表位。

有机磷农药广谱抗原表位多肽的制备及应用

利用噬菌体展示技术,以广谱型单克隆抗体筛选十二肽噬菌体展示库,获得能够模拟有机磷类农药抗原表位的十二肽,建立了一种间接竞争ELISA方法用于检测多种有机磷类农药。结果表明,获得的特异性多肽氨基酸序列为HPAPDHSSQSHQ,呈现出较好的抗原性、亲水性及表面可及性,可广谱模拟有机磷农药抗原表位。所建立的间接ELISA方法对有机磷农药通用结构半抗原(BPB)的IC50和IC10分别为1.776μg/ml及0.358μg/ml,与对硫磷、蝇毒磷、乙拌磷、辛硫磷、喹硫磷和三唑磷的交叉反应率分别为58.74%、44.93%、52.03%、43.98%、36.82%和4.87%。建立的检测方法具有绿色、广谱、高效的特点,是一种新型有机磷类农药累积毒性检测技术。

脂多糖模拟肽13L诱导对小鼠内毒素休克的保护反应

为研究LPS 2630表位模拟肽13L是否能诱导抗脂多糖(LPS)抗体的产生、对细菌攻击及内毒素休克的保护性反应,合成了模拟LPS表位的短肽13L.用合成肽13L-蓝载体(blue carrier,BC)交联物免疫Balb/C小鼠,观察小鼠体内抗LPS抗体产生的规律,并观察免疫小鼠细菌感染存活时间,用颈总动脉插管测定技术观察免疫小鼠内毒素休克的血压变化.结果显示,合成肽13L-BSA交联物能与兔抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗血清及抗鼠伤寒LPS单抗结合,证明短肽13L可模拟LPS的抗原性.用13L-BC交联物免疫可诱发小鼠体内针对大肠杆菌LPS 2630和鼠伤寒沙门氏菌LPS 7261的抗体反应,该反应可被灭活大肠杆菌及两种LPS所加强,其抗体亚类主要为IgG2a,其次为IgG2b与IgM,而IgG1与IgG3含量极低.免疫13L-BC小鼠显示对细菌攻击的抵抗,与免疫BC对照小鼠比较,其存活时间分别为(12±1.3)天和(5.3±0.4)天(P<0.01).免疫13L-BC小鼠对静脉注射LPS诱发内毒素休克的保护作用体现在血压下降幅度明显低于对照动物,在LPS 2630攻击后1、2、3及4h时两组动物血压明显差别(P<0.05、P<0.01、P<0.05及P<0.01),而LPS 7261攻击后1、2、3及4h时两组动物血压差别则略小于LPS 2630组(P>0.05、P<0.05、P<0.05及P<0.01).上述结果证明,LPS表位模拟肽13L交联物免疫小鼠可产生针对细菌攻击及内毒素休克的保护性效应,提示该模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性.

MUC1模拟表位肽致敏DC治疗宫颈癌荷瘤小鼠

目的研究黏蛋白1(MUC1)模拟表位肽致敏树突状细胞(DC)对宫颈癌荷瘤小鼠生长和T淋巴细胞亚群的影响。方法培养小鼠骨髓细胞,诱导并刺激DC成熟,将MUC1模拟表位肽加入成熟DC,形成负载MUC1模拟表位肽的DC。建立稳定表达MUC1的宫颈癌U14细胞株荷瘤BALB/c小鼠模型。空白对照组注射0.2 mL生理盐水;DC组注射2×10^(5)个未加MUC1模拟表位肽的DC;DC+MUC1组注射2×10^(5)个经过负载MUC1模拟表位肽的DC。免疫1周后,进行二次免疫。结果肿瘤体积与治疗前比较,空白对照组、DC组和DC^(+)MUC1组均升高(P<0.05);治疗前,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);二次免疫1周后,DC^(+)MUC1组低于空白对照组和DC组(P<0.05),空白对照组和DC组间差异无统计学意义(P>0.05);小鼠抑瘤率DC组和DC+MUC1组均高于空白对照组(P<0.05),DC+MUC1组高于DC组(P<0.05);小鼠外周血CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平DC^(+)MUC1组高于空白对照组和DC组(P<0.05),空白对照组和DC组间差异无统计学意义(P>0.05);CD4^(+)CD25^(+)FOXP3^(+)Treg水平和小鼠血清白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮因子(VEGF)水平DC+MUC1组低于空白对照组和DC组,空白对照组和DC组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论MUC1模拟表位肽致敏DC可抑制宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤生长,调节T淋巴细胞亚群水平,改善细胞因子表达。

用随机肽库筛选胃癌相关抗原MGb2-Ag模拟肽表位

的 运用肽库筛选技术寻找胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２ 所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位。方法 以胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２ 作为筛选配基，对呈现于噬菌体衣壳蛋白ｐⅧ上的两个九肽库进行了亲和富集和免疫筛选；阳性克隆用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹证实结合活性；随机抽取部分阳性克隆进行了ＤＮＡ 测序分析。结果 经ＤＮＡ 测序分析推导出相应的氨基酸序列并加以比较分析，得到具有保守性的表位信息。结论 具有相对保守性的ＶＣＸＸＤＧＶ 可能为胃癌单克隆抗体ＭＧｂ２所识别的表位基序。

噬菌体抗原模拟表位的免疫原性研究

目的 通过研究胃癌相关抗原的短肽模拟表位的免疫原性 ,探讨肿瘤抗原表位的噬菌体模拟肽是否具有免疫原性 ,为进一步的胃癌疫苗研制奠定实验基础。方法 以胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原表位模拟肽为免疫原 ,免疫Balb/c小鼠 ,获得免疫血清 ;用表达MG7单抗所识别的相应抗原的胃癌组织切片 ,通过免疫组化方法筛选免疫血清 ;在此基础上 ,对阳性血清进一步用细胞荧光标记法和ELISA法进行了检测。结果 免疫血清经免疫组化筛选和细胞荧光标记法及ELISA法检测 ,发现其中一个噬菌体呈现的表位模拟肽的免疫血清可与人胃癌组织间呈现特异的免疫反应 ,由此筛选出具有免疫原性的胃癌相关抗原表位的噬菌体模拟肽。结论 用单克隆抗体从随机肽库中筛选得到的部分表位模拟肽具有引发识别原始抗原免疫反应的免疫原性 ,提示以肿瘤相关抗原的表位模拟肽为基础研制疫苗具有可行性 ,可望在机体内诱发有效的体液免疫反应。