猪笼液蛋白酶消减牛乳蛋白致敏表位的研究

目的:利用废弃猪笼液中的蛋白酶来消减牛乳主要致敏原蛋白的致敏性。方法:首先采集了米兰达猪笼草(Nepenthes×Miranda)的猪笼液,经过滤、5 kDa膜超滤、真空冷冻干燥和复溶获得酶活为126.276 U/mL的猪笼液蛋白酶液。然后用此酶对牛乳蛋白进行酶解,通过液相色谱-二级质谱法(LC-MS/MS)鉴定酶解后肽段产物,对比致敏原表位数据库以判断蛋白酶对表位的酶切情况。结果:牛乳主要致敏原蛋白中P1位的K、V、F、R、Y、I、S和L以及P1’位的D、A、V、I、L、F、E、R、Y、N、T、Q、S、W和P的肽键被有效酶解,酶切位点位于相对应的表位内,且位于蛋白表面和内部的表位均有被酶解。其中,来自α-LA的表位Eα-LA1中的K-V以及表位Eα-LA2中的K-V和K-A被酶解频率较高,来自β-LG的被酶解频率高的表位处的肽键为Eβ-LG1和Eβ-LG2中的L-D、V-Y和Y-V,来自αs1-CN的表位Eαs1-CN1中大部分的R-F和F-F被高频酶解,来自αs2-CN的表位Eαs2-CN1中的L-N、R-Y、K-F和K-T和表位Eαs2-CN2中的K-T、K-L和K-I被酶解频率较高,β-CN中被酶解频率较高的表位为Eβ-CN1和Eβ-CN2中的L-Q、S-W、D-V、L-T、T-D和E-N。结论:猪笼液蛋白酶水解对牛乳蛋白致敏原蛋白表位表现出不同程度的破坏作用,猪笼液有望成为新型蛋白酶开发的资源,实现农业废弃物再利用。

大豆球蛋白G5A3亚基加工破坏表位的初步定位

大豆球蛋白是重要的大豆过敏原,为探究大豆球蛋白G5亚基中A3酸性多肽链的破坏表位,对A3亚基的基因进行重叠分段并设计合成引物、构建克隆载体后进行双酶切,与T7 vector arms连接构建重组噬菌体并表达目的蛋白;制作热处理及超高压联合热处理破坏抗原表位的特异性抗体,用间接竞争ELISA法检测不同肽段的抗原性高低及加工破坏表位。结果表明,A3链与其3个分段基因的长度分别为:960、420、450、450 bp,与预期片段大小相符;经间接竞争ELISA法检测后,片段1抗原性最高,通过阴性对照,超高压联合热处理对该亚基的破坏效果优于单独热处理试验,其中对片段1的破坏效果最好。因此,超高压联合热处理的方法对蛋白抗原性破坏效果显著,且对片段1破坏最强。