狂犬病病毒中和单抗表位鉴定和中和广谱性评价研究进展

目的:对狂犬病病毒(RABV)中和单抗的研发进展及其表位和中和广谱性研究评价进行综述,为行业提供参考。方法:通过文献检索,对国内外开展的狂犬病病毒中和单抗研究进行梳理和汇总。结果与结论:中和抗体在狂犬病暴露后预防中发挥着重要的作用,目前国内外已有多个RABV单抗品种上市并有多个品种处于临床评价阶段。RABV具有较高的突变频率且感染发病后致死率极高,为了最大程度地中和自然流行的RABV病毒株,以防止感染后狂犬病的发生,在单抗候选药物研发时应对其表位和广谱性进行充分的研究评价。

CD8^+T细胞表位鉴定技术研究进展

CD8^+T细胞表位通过MHCⅠ分子呈递到细胞表面,激活CTL细胞从而介导并调节机体抗内源性抗原的免疫应答。MHC-peptide稳定性试验通过TAP缺陷的RMAS细胞转染克隆在细胞水平鉴定CD8^+T细胞表位与MHCⅠ分子的亲和力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)通过检测IFN-γ的分泌水平评估抗原免疫后机体的细胞免疫应答能力,具有较高的敏感性和高效性。四聚体技术通过流式细胞仪分析抗原特异性CD8^+T细胞的表型和功能特征。论文介绍了CD8^+T细胞表位的特征和上述3种表位鉴定方法的基本原理和研究进展,为CD8^+T细胞表位的鉴定和表位疫苗的研制提供参考。

抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其应用

目的制备抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),鉴定其基本特性并通过配对检测临床样本血清,对已配对的mAb进行表位鉴定。方法通过已制备的H-FABP抗原和合成肽免疫BALB/c小鼠,常规融合筛选后进行抗体亚型鉴定、效价和亲和力检测,纯化mAb后通过间接ELISA、Western blot法对mAb进行特异性检测;将获得的mAb分别作为捕获和检测抗体,经过配对建立检测重组H-FABP的ELISA体系,并初步用于临床血清检测;采用生物信息学分析设计2段H-FABP表位,通过原核表达获得其短肽并纯化,通过Western blot法对配对的mAb进行表位鉴定。结果成功获得4株抗H-FABP特异性mAb,亚类分别为IgG2a和IgG2b,抗体效价为1∶51 200～1∶1024 000,亲和力最高可达到9.02×109mol/L;经Western blot法和间接ELISA鉴定均能够特异检测重组H-FABP蛋白,经过配对发现mAb 3-H5和1-F10能够检测重组H-FABP,并在其临床血清样本检测中发现正常组和急性心梗组之间H-FABP水平具有显著性统计学差异;通过表位鉴定发现未知表位的mAb 1-F10能够特异识别位点为H-FABP的第86到第133位氨基酸。结论制备了4株高特异性和高亲和力的抗H-FABPmAb,成功建立了检测临床样本血清中的ELISA体系,并对其表位进行了分析鉴定。

一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明:成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g D蛋白抗原表位,本研究利用p ET-30a原核表达系统表达、纯化了重组g D蛋白,采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组g D蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗g D蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1G3)。间接免疫荧光结果表明:MAb与IBRV呈阳性反应,中和试验测定其腹水中和效价为1∶32。利用肽扫描技术原核表达GST融合短肽对MAb 1G3识别的抗原表位进行筛选鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为259EESKGYE265。蛋白序列分析表明该抗原表位在IBRV各分离株及牛疱疹病毒5型(Bo HV-5)中均保守。本研究为IBRV的糖蛋白g D的结构和免疫学特性及IBRV致病性的深入研究奠定了基础。

肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位4分支多重抗原肽的合成及鉴定

目的 设计合成肿瘤抗原MAGE 12的B细胞表位抗原肽并对其进行鉴定。方法 在预测MAGE 12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82 -93 )的基础上 ,采用 4分支多重抗原肽结构合成抗原肽 ,免疫C 5 7BL 6小鼠 ,产生多克隆抗体 ,应用ELISA实验及免疫组化实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。结果 免疫C 5 7BL 6小鼠后可产生MAGE 12的抗原特异性的多克隆抗体 ,抗体滴度可达 1∶64。结论 证明所预测的表位为MAGE 12的B细胞表位。

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。

CD4＋T细胞表位分析鉴定技术研究进展

CD4+T细胞表位通过激活CD4+T细胞从而介导并调节抗肿瘤或抗感染免疫反应。本文根据CD4+T细胞表位分析方法的最新研究进展,简要介绍CD4+T细胞表位预测分析法与实验鉴定法的基本原理和方法,为高通量筛选和鉴定CD4+T细胞表位提供指导。

肿瘤抗原MAGE-2 HLA-A2限制性新CTL表位的鉴定

目的 寻求新的HLA A2限制性肿瘤抗原MAGE 2CTL表位。方法 经超基序与量化基序相结合预测的肿瘤抗原MA GE 2的 4个表位作为研究对象 ,标准的51 Cr实验与肽结合实验相结合进行验证。结果 预测表位肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8,MAGE 2 2 71 2 79经体外刺激PBMC后可有效的诱导CTL效应产生 ,当效 靶为 10 0∶1时溶破靶细胞效率分别为 74 4% ,68 2 %。HLA A2分子亲和力分析 ,荧光系数分别为 0 61、0 2 4阳性肽荧光系数为 0 79。结论 多肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8、MAGE 2 2 71 2 79可作为新的HLA A2限制性CTL表位。

SOX2抗原HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及鉴定

目的 预测和鉴定SOX2抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位,通过体外实验筛选出能诱导机体特异性杀伤肺癌肿瘤细胞的抗原表位。方法 应用生物信息学软件SYFPEITHI、BIMAS、ProPred-I对SOX2蛋白进行优势表位的预测和筛选。通过T2细胞结合实验检测不同多肽组在不同肽浓度条件下HLA-A2分子平均荧光强度增加百分数(%MFI increase)来考察表位肽与MHCⅠ类分子的结合力强弱;用优势表位肽诱导PBMCs、T2细胞分别产生效应细胞和靶细胞,通过hIFN-γELISPOT实验检测IFN-γ斑点数、LDH释放实验检测光密度(OD)值来考察效应细胞对靶细胞的杀伤力。结果 预测所得优势表位肽:SMYLPGAEV、TLMKKDKYT、ALGSMGSVV。随着表位肽浓度的增高,SMYLPGAEV组平均荧光强度增加百分数逐渐升高,当肽浓度为50μmol/L和100μmol/L时明显高于TLMKKDKYT、ALGSMGSVV、阳性肽和阴性肽组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LDH释放实验结果显示表位肽SMYLPGAEV、TLMKKDKYT组的OD值高于其他肽组,差异具有统计学意义(P<0.05)。hIFN-γELISPOT实验结果显示表位肽SMYLPGAEV诱导的CTLs较另两种表位肽诱导的CTLs能产生更多的IFN-γ斑点,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 在SOX2抗原的众多天然表位肽中,SMYLPGAEV具有较强免疫原性,有望用于制备肺癌治疗性疫苗。

猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定

为鉴定抗猴免疫缺陷病毒(SIV)衣壳蛋白p27单克隆抗体(MAb)p27-A5、p27-C7和p27-D2所识别的抗原表位,本研究通过间接ELISA法相加试验对这3株MAbs结合抗原表位进行初步分析,并利用部分重叠的短肽对MAbs的结合抗原表位进行鉴定。结果表明p27-C7和p27-A5的结合抗原表位位于p27蛋白的aa61～aa76(氨基酸序列为61SEGCTPYDINQMLNCV76);p27-D2的结合抗原表位则位于aa191～aa206(氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206)。该结果为进一步深入了解p27的抗原特性和建立该蛋白的检测方法奠定了基础。

人凝血因子IX的线性B细胞表位预测及鉴定

为预测并鉴定人凝血因子IX(FIX)的线性B细胞表位.通过IEDB数据库及Discovery Studio软件预测FIX的B表位和白喉毒素T结构域(DTT)的B表位,用所预测的FIX的B表位替换某预测的DTT的B表位形成DTT-表位融合蛋白.通过基因工程技术制备各重组蛋白,并免疫小鼠,通过ELISA和Western-blot检测抗血清效价和特异性,通过等温量热滴定技术(ITC)测定抗体的亲和力.预测到4个FIX的B表位.用重组蛋白FIX-2-DTT免疫的小鼠产生了识别完整FIX的抗体,该抗体具有良好的特异性,其结合常数KD为106 M-1.表明FIX-2(306 NAAINKY312)是FIX的B表位,用重组蛋白FIX-2-DTT免疫小鼠能够产生特异性识别FIX且亲和力温和的抗体.

猪丹毒丝菌GAPDH线性B细胞表位预测与鉴定

为预测并鉴定猪丹毒丝菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)分子线性B细胞表位,首先通过多序列比分析已经全基因组测序的10株菌株的GAPDH一级结构保守性;然后使用在线软件Bepipred-2.0预测猪丹毒丝菌GAPDH线性B细胞表位,接下来通过人工化学合方式合成GAPDH表位对应的多肽;最后使用间接ELISA法检测这些多肽与猪丹毒丝菌GAPDH高免血清之间的反应。研究发现已经完成全基因组测序的10株菌株的GAPDH一级结构高度保守。通过软件预测,找到了猪丹毒丝菌GAPDH的3个潜在的表位。ELISA检测结果表明74VLSERDPKNLPWKELGV90和178HAYTNDQNTLDGPHAKGDLRRGRAAAQSIIPNSTGA213与GAPDH高免血清反应明显,是猪丹毒丝菌GAPDH的表位。成功预测并鉴定到2个猪丹毒丝菌的抗原表位,这些表位将为以后基于猪丹毒丝菌GAPDH表位的诊断、疫苗设计及致病机制研究提供技术基础。

巴氏杆菌GAPDH线性B细胞表位预测与鉴定

首先通过多序列比对分析不同血清型菌株GAPDH的一级结构保守性,然后使用在线软件Bepipred-2.0预测巴氏杆菌GAPDH线性B细胞表位,并通过人工化学合方式合成GAPDH表位对应的多肽。最后使用间接ELISA法检测这些多肽与巴氏杆菌GAPDH高免血清之间的反应,确认预测结果。研究发现,不同血清型菌株的GAPDH一级结构高度保守,只有D型菌株HN06发生A288T突变。本次试验预测到巴氏杆菌GAPDH的3个表位,ELISA检测结果表明_(177)HATTATQKTVDGPSAKDWRGGRGAAQNIIPSSTGA_(211)与GAPDH高免血清反应明显,是巴氏杆菌GAPDH的表位。本研究鉴定到了巴氏杆菌GAPDH的1个线性B细胞表位,这些表位将为以后基于巴氏杆菌GAPDH表位的诊断、疫苗设计及感染与免疫机制研究提供技术基础。

浅谈人脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)表位肽的设计与鉴定

目的 :探讨人脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)表位肽的设计与鉴定方法。方法 :采用多参数生物信息学共同分析的方法对人LPPLA2进行表位设计,通过直接化学合成表位标签蛋白获得表位肽,用亲和纯级抗LP-PLA2重组蛋白多克隆抗体对合成的表位标签蛋白进行鉴定。结果:采用多参数生物信息学共同分析的方法成功设计并合成了人LP-PLA2的6段线性表位肽(P1～P6)。对这6段线性表位肽采用亲和纯级抗重组LPPLA2多克隆抗体进行鉴定的结果显示,其均能与多克隆抗体发生反应。在这6段线性表位肽中,有3段表位肽的效价具有较高的滴度。结论 :采用多参数生物信息学的方法能成功地分析出LP-PLA2潜在的线性表位,通过直接化学合成可快速地得到相应的表位标签蛋白,从而为LP-PLA2单克隆抗体的制备提供更多的免疫原选择,并为LP-PLA2检测试剂盒的研发提供更为快捷的筛选途径。

MAGE-12 B细胞表位联合应用的免疫原性研究

目的设计合成肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位并研究其表位联合应用的免疫原性。方法在MAGE-12的B细胞表位序列MAGE-123-14(LEQRSQHCKPEE)、MAGE-1282-93(QSDEGSSNEEQE)的基础上,采用4分枝多重抗原肽结构设计合成抗原肽后分MAGE-123-14组、MAGE-1282-93组、MAGE-123-14联合MAGE-1282-93组,分别以MAGE-123-14、MAGE-1282-93、MAGE-123-14联合MAGE-1282-93抗原肽免疫C-57BL/6小鼠,产生多克隆抗体,应用ELISA和免疫组化实验检测多克隆抗体是否为抗原肽的特异性抗体。结果免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体,且多表位抗原肽联合使用组抗体效价高于单表位抗原肽组产生的抗体效价。结论证明MAGE-12的B细胞多表位抗原肽联合使用的免疫原性强于单个B细胞表位抗原肽的免疫原性。

禽戊型肝炎病毒人兽共感染的可能性研究

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要经肠道传播,临床表现与甲型肝炎类似,主要流行于亚洲、非洲和中美洲的发展中国家。急性肝损坏和散发急性肝炎病例中50%以上由戊型肝炎引起。这使戊型肝炎成为一个重要的公共卫生问题。随着猪HEV的发现,禽HEV于2001年由美国的Meng博士领导的研究室发现和鉴定。在过去的几年里,我们与Meng博士研究室合作对禽HEV结构蛋白(ORF2)的B细胞抗原表位做了较系统的研究,鉴定出两个中和抗原表位,证明了禽HEV ORF2基因重组抗原免疫后能够产生中和抗体并可以防止禽HEV的感染。我们同时阐明了在禽HEV ORF2抗原内至少有一个禽HEV特异的抗原表位,一个人、猪和禽HEV三种病毒共有的抗原表位,至少有一个禽、人HEV共有的抗原表位。这些研究结果表明禽HEV ORF2蛋白的抗原表位可以作为有效的免疫诊断抗原,用来鉴别人和禽HEV感染。我们最近对健康人群HEV血清抗体检测结果表明抗禽HEV ORF2抗体阳性率约为1%,其中约4.5%的人群血清中含抗人HEV抗体。在对鸭群的血清学检测证明健康鸭群的抗禽HEV ORF2抗体阳性率约为20%。这些研究结果提示人可能被禽HEV感染。