半夏泻心汤对小鼠Cajal间质细胞表型维持及相关钙离子通道蛋白的影响

目的通过观察小鼠胃Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)表型变化及相关蛋白,讨论半夏泻心汤调节胃肠运动的细胞分子机制。方法制备半夏泻心汤药物血清,以去离子水灌胃所得血清为对照。取对数生长期的ICC,随机分为空白组、对照组、低浓度组(5%半夏泻心汤药物血清)、中浓度组(10%半夏泻心汤药物血清)和高浓度组(20%半夏泻心汤药物血清),分别给予相应药液,于12小时、24小时和48小时后进行指标检测。采用免疫荧光双染法检测ICC标记蛋白c-kit/α-SMA、c-kit/desmin和c-kit/SMMHC表达,镜下观察半夏泻心汤对小鼠ICC表型维持的影响;采用免疫印迹和实时荧光定量PCR法检测ICC中钙离子通道蛋白三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptors,IP3R)、兰尼碱受体(ryanodine receptor,RyR)、磷脂酶C(phospholipases C,PLC)及其mRNA的表达。结果与低浓度和中浓度组相比,高浓度组c-kit阳性表达显著增加(P<0.05),α-SMA阳性表达明显减少(P<0.01),SMMHC表达和desmin表达差异不显著(P>0.05)。与药物干预24小时、48小时组相比,12小时组c-kit阳性表达显著增加(P<0.05);与48小时组相比,12小时组α-SMA阳性表达明显降低(P<0.05);与24小时相比,12小时组α-SMA、desmin和SMMHC平均灰度值无明显差异(P>0.05)。与空白组、对照组比,药物组IP3R、RyR、PLC蛋白及mRNA表达均明显升高(P<0.05)。结论20%半夏泻心汤药物血清干预12小时能显著增强ICC表型的维持,加强c-kit表达,其机制可能与调节钙库受体蛋白IP3R、RyR、PLC表达水平,进而影响相关离子通道蛋白有关。

载穿心莲内酯胶原缓释支架促进体外炎症环境下软骨细胞表型维持的研究

本文主要研究载穿心莲内酯胶原缓释支架对炎症环境下软骨细胞维持表型的作用。通过物理共混结合真空冷冻干燥的方法制备载穿心莲内酯胶原缓释支架,采用环境扫描电子显微镜(ESEM)、真密度仪和紫外可见分光光度计表征载药支架的形貌、开孔率和药物释放情况。将经分离、扩增培养后的兔关节软骨细胞接种于载穿心莲内酯胶原缓释支架上,在常规培养液条件下培养3 d、白细胞介素1β(IL-1β)模拟的炎症环境下培养7 d,期间采用阿尔玛蓝(Alamar Blue)、荧光素二乙酸(FDA)染色、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)等方法研究所制备支架对软骨细胞的增殖和表型的影响。实验结果表明,真空冷冻干燥法制备的胶原支架孔连通性良好,平均孔径为(120.7±17.8)μm,开孔率可达96%,该载药支架可在两周内实现药物的持续释放。Alamar Blue实验结果表明,质量分数为2.22%的载穿心莲内酯胶原缓释支架可显著抑制软骨细胞增殖,而其它载药浓度的胶原缓释支架对炎症环境下软骨细胞的增殖无显著影响。FDA染色结果表明,质量分数为0.44%的载穿心莲内酯胶原缓释支架可降低IL-1β对软骨细胞形貌的改变,且该浓度载药支架可显著抑制基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的转录,促进基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、软骨细胞外基质相关基因II型胶原(COL II)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的转录,提高COL II/I型胶原(COL I)的比值。基于以上研究结果,表明质量分数为0.44%的载穿心莲内酯胶原缓释支架可以抑制IL-1β模拟的炎症环境下软骨细胞内不利于维持表型的基因(如:MMP-1、MMP-13)的转录,促进利于维持表型的基因(如:COL II、Aggrecan、TIMP-1)的转录,从而增强炎症环境下的软骨细胞维持其表型的能力,有望用于关节炎软骨损伤修复。

MGr1—Ag维持耐药表型与蛋白激酶C有关

［韩英，时永全，郑永悦，聂永战，张宏博，张淼莉，潘伯荣，樊代明. 世界华人消华杂志，2001;9(5):517-521］ 目的探讨MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C的关系. 方法用免疫细胞化学方法检查MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系的表达；ELISA及点印迹方法检测胃癌SGC7901细胞系及其耐药亚系细胞培养上清中MGr1-Ag的表达；免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察MGr1-Ag与PKCα的相关表达；竞争蛋白结合法检测单克隆抗体MGr1-1对PKC活性的影响. 结果 MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系均有表达，以耐药细胞表达明显增多；ELISA及点印迹实验证实在表达MGr1-Ag的细胞培养上清中均可检测到MGr1-Ag；耐药细胞PKCα与MGr1-Ag的相关表达较药敏细胞明显增强；单克隆抗体MGr1-1与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC降低较明显. 结论 MGr1-Ag可能是一种分泌蛋白，MGr1-Ag维持SGC7901/VCR耐药细胞系的耐药表型可受PKC信号转导通路的调节.

模拟微重力环境下威灵仙维持兔膝关节软骨细胞表型的效应与机制

目的研究模拟微重力培养环境下威灵仙提取物对兔软骨细胞表型维持的作用及机制。方法利用液动力聚焦细胞培养系统体外模拟微重力培养环境,同时使用威灵仙提取物进行干预,将兔膝关节软骨细胞分为空白组(平面培养)、威灵仙组(平面培养+威灵仙提取物)、微重力组(微重力培养)、微重力-威灵仙组(微重力培养+威灵仙提取物)4组,培养7 d;观察各组软骨细胞形态学变化,CCK-8检测各组细胞增殖活性,流式细胞技术检测各组软骨细胞凋亡率;RT-qPCR检测成软骨相关mRNAⅡ型胶原蛋白、蛋白多糖、TGF-β、SOX9,以及与软骨去分化相关mRNA MMP13、Ⅰ型胶原蛋白;Western blotting检测Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、TGF-β及MMP13蛋白表达;同时对细胞内葡萄糖、ATP、乳酸含量进行检测,评估各组软骨细胞能量代谢状态。结果形态学观察显示微重力组、微重力-威灵仙组软骨细胞保持良好形态,空白组、威灵仙组梭形细胞增多。与空白组相比,模拟微重力培养条件与威灵仙提取物均能提高软骨细胞48,72 h的增殖活性,降低细胞凋亡率,上调蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、TGF-β的蛋白及mRNA表达,降低MMP13的蛋白及mRNA表达,上调SOX9 mRNA表达,降低Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,上调软骨细胞内葡萄糖、ATP、乳酸含量,两者结合效果最为显著(P<0.01)。结论模拟微重力培养环境与威灵仙提取物均能够促进软骨细胞能量代谢,保持增殖活性以及软骨细胞表型维持,而二者联合应用可以发挥协同作用。

模拟微重力培养环境下载威灵仙丝素蛋白微球对软骨细胞表型分化的影响

目的:研究模拟微重力培养环境下载威灵仙丝素蛋白微球三维培养对软骨细胞表型分化的影响及机制。方法:高压静电法结合冷冻技术制备载威灵仙总皂苷的丝素蛋白多孔微球,扫描电镜观察支架的形貌及孔隙,香草醛-高氯酸显色方法检测威灵仙总皂苷的释放率。利用液动力聚焦细胞培养系统体外模拟微重力培养环境,将提取的兔膝关节软骨细胞分为3组:空白组,空白微球组、载威灵仙微球组,培养7d后收集细胞;观察各组软骨细胞的形态及与丝素蛋白微球的黏附情况,CCK-8检测各组细胞增殖活性,RT-qPCR检测软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、TGF-β、SMAD2的mRNA表达,Western blotting检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的蛋白表达。结果:构建的丝素蛋白微球具有较好的孔隙,载威灵仙总皂苷的丝素蛋白微球具有良好的缓释效果;模拟微重力条件下软骨细胞能够自发的黏附于丝素蛋白微球载体;且与空白组比较,模拟微重力培养条件下载威灵仙总皂苷微球软骨细胞增殖率显著增加(P<0.01),蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、TGF-β、SMAD2表达均显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论:载威灵仙总皂苷丝素蛋白微球载体具有良好缓释效果及细胞相容性,在模拟微重力培养环境下能够使软骨细胞黏附进行良好的黏附扩增,提高软骨细胞增殖活性,上调软骨细胞TGF-β/SMAD2活化水平,促进软骨细胞的基质分泌。