土大黄提取物对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT)增殖的影响

目的土大黄根醇提物化学组分分析及其对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)增值的影响。方法利用D101大孔树脂、HPLC对土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)进行分离纯化、主要化学组分分析,同时观察对HaCaT细胞增殖的作用。结果通过D101大孔树脂处理得到了30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的出膏率分别为5.4%、14.8%、11%、0.72%。HPLC检测得知,30%洗脱部位占0.151%,成分为大黄素;50%洗脱部位占1.952%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;70%洗脱部位占21.409%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;90%洗脱部位占1.927%,成分为大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)占1.591%,成分为芦荟大黄素和大黄酸;对HaCaT细胞增殖的抑制作用由强到弱依次为90%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位、70%乙醇提取物(原粗提取物)、30%乙醇洗脱部位,抑制率分别为17.55%、16.66%、10.99%、10.25%和7.86%。结论土大黄根醇提物70%乙醇洗脱部位是最佳富集部位(21.409%)、也是最佳洗脱部位。土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)及其不同洗脱部位均对HaCaT细胞增殖具有一定的抑制作用,其作用可能与土大黄所含的蒽醌类成分有关,提示土大黄具有治疗银屑病的作用。

基于Notch信号通路探讨银屑平丸含药血清对TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞相关蛋白及炎症因子的影响

目的基于调节Notch信号通路探讨银屑平丸含药血清对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人表皮角质形成细胞相关蛋白及炎症因子的影响。方法根据中药血清药理学方法制备银屑平丸含药血清、阿维A含药血清,将血清分为5%、10%、20%3个浓度对人表皮角质形成细胞进行干预,采用CCK-8试剂筛选含药血清最佳作用浓度;建立TNF-α诱导的银屑病细胞损伤模型,设置空白组、模型组、银屑平丸含药血清组、阿维A组、模型+γ-分泌酶抑制剂(DAPT)组、银屑平丸含药血清+DAPT组。采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)水平,采用Real-timePCR法检测Notch信号通路Notch1,Jagged-1表达,免疫荧光法检测各组细胞内皮蛋白(Involucrin)表达水平。结果TNF-α最佳作用浓度为10 ng·mL^(-1),银屑平丸含药血清最佳作用浓度为20%。与空白组比较,模型组可使各组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(均P<0.0001),Notch1、Jagged-1表达上调(均P<0.0001),并使细胞Involucrin荧光表达增强(P<0.0001);与模型组比较,银屑平丸含药血清组可使细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05,P<0.01),使Notch信号通路Notch1、Jagged-1表达下调(均P<0.0001),并使细胞Involucrin荧光表达减弱(P<0.05);与银屑平丸含药血清组比较,银屑平丸含药血清+DAPT组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.0001,P<0.05,P<0.01),Notch1、Jagged-1表达下调(均P<0.0001),细胞Involucrin荧光表达减弱(P<0.05)。结论银屑平丸含药血清可抑制TNF-α诱导的人表皮角质形成细胞增殖,降低炎症因子表达水平及人表皮角质形成细胞相关蛋白表达,其机制可能与调节Notch信号通路有关。

P物质受体在人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控

目的考察P物质受体(Neurokinin1R,NK1R)在正常人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控特征。方法培养人表皮角质形成细胞株HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,应用免疫组织化学法检测NK1R在两种细胞中的表达;采用RTPCR方法检测NK1R在两种细胞mRNA水平的表达特征,并采用流式细胞术定量检测在不同刺激因素及药物作用下两种细胞中NK1R的表达调控情况。结果NK1R在HaCaT细胞及真皮成纤维细胞中均有表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质。NK1RmRNA在HaCaT细胞上的表达水平要高于在真皮成纤维细胞上的表达。P物质和IFNγ可以上调NK1R在两种细胞上的表达,而LPS抑制了NK1R的表达;抗组胺药盐酸西替利嗪和P物质受体特异性拮抗剂SpantideI可以降低两种细胞上NK1R的表达。结论皮肤角质形成细胞和真皮成纤维细胞在细胞、蛋白及mRNA水平均有NK1R的表达,而且这种表达可被过敏炎症因子调控,提示角质形成细胞和真皮成纤维细胞参与了皮肤免疫调控,神经肽P物质可能在皮肤过敏性炎症中起重要作用。

人表皮角质形成细胞Toll样受体表达

目的研究人表皮角质形成细胞Toll样受体表达谱。方法培养人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK),采用分散酶分离表皮。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测10种Toll样受体mRNA表达,流式细胞仪检测HaCaT细胞和NHEK表面Toll样受体2和4蛋白的表达。结果HaCaT细胞、NHEK以及分离的表皮均有全部10种Toll样受体mRNA表达,其表达强弱各不相同。流式细胞仪检测显示HaCaT细胞和NHEK表面有Toll样受体4蛋白的表达,而Toll样受体2无明显表达。结论人表皮角质形成细胞中有Toll样受体1～10mRNA的组成性表达。

诱导表皮角质形成细胞体外分层的途径及机制

目的 探讨诱导表皮角质形成细胞体外分层途径及机制。方法 在体外培养状态下,利用气液界面培养法及高浓度钙离子诱导胎鼠皮片、表皮角质形成细胞分层,借助冰冻切片、免疫荧光及激光共聚焦等技术检测其分层层数及分化程度。结果 胚胎龄16d的胎鼠皮片经气液界面培养3d后,其表皮基底上角质形成细胞由2层增加为5层;经气液界面培养7d后,胎鼠皮片表皮基底上角质形成细胞的局部区域分层已可达8层,细胞呈现更为分化的形态。在高浓度Ca2 + (1 5mmol L)条件下培养7d后,培养角质形成细胞发生了分层,分化标记物角蛋白K10在分层角质形成细胞中的表达明显增加。结论 气液界面培养法及高浓度钙离子能诱导表皮角质形成细胞的体外分层,同时促进其分化。

基于太极阴阳鱼图探讨表皮角质形成细胞的阴阳变化

基于太极阴阳鱼图的特点,即圆运动的连续性、阴阳消长的动态平衡及阴阳互藏性,探讨表皮角质形成细胞演变过程中的阴阳变化,认为基底层、棘层表现出阳的属性,颗粒层、角质层表现出阴的属性,棘层与颗粒层是由阳转阴,重阳必阴关键。

小鼠表皮角质形成细胞中Ca^(2+)对组织型纤溶酶原激活剂表达的调节

目的 探讨小鼠表皮角质形成细胞(KC)中Ca^(2＋)对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）表达的调节作用及其与分化的关系。方法采用免疫组化及原位杂交技术定性、定量检测低Ca^(2＋)( 0.05 mmol/L)及高Ca^(2＋)(1.5 mmol/L)浓度对tPA、tPA mRNA的表达及表皮KC分化的影响。结果与未经Ca^(2＋)处理的对照相比，低Ca^(2＋)浓度下培养的表皮KC中，tPA mRNA及tPA量均增加（P< 0.05），KC分化标记物K10抗原表达为弱阳性，KC胞体较小，细胞形态趋于圆形；而高Ca^(2＋)浓度下的培养表皮KC中，tPA mRNA及tPA量显著增加（P< 0.001），K10抗原呈强阳性表达，KC胞体增大,形态为典型的多角形。结论Ca^(2＋)浓度的增高促进了tPA mRNA及tPA的表达，并与KC分化有关。

人表皮发生的机制研究:C/EBP在调控体内外角质形成细胞分化中的作用

目的:探讨CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbindingprotein,C/EBP)参与表皮角质形成细胞分化调控的作用。方法:①应用免疫组化的方法检测胚胎表皮中C/EBP的表达情况;②通过调节培养的鼠表皮角质形成细胞培养基中钙离子浓度,在不同时间段应用免疫细胞化学检测C/EBPα和C/EBPβ的表达情况。结果:C/EBPα和C/EBPβ主要表达在胚胎期表皮棘层、颗粒层和角质层细胞的胞核内。在培养的角质形成细胞胞核中随分化进行表达增强。结论:说明C/EBP参与表皮角质形成细胞分化调控。

小鼠表皮角质形成细胞中TNF-α对PAI-2表达的调节

目的 探讨表皮角质形成细胞中TNF α对PAI 2表达的调节及其生物学意义。方法 利用免疫细胞化学、TUNEL反应及免疫细胞化学 TUNEL双标等方法 ,观察TNF α作用下 ,培养的表皮角质形成细胞及其脱落细胞中PAI 2表达的变化及凋亡发生的情况。结果 在TNF α作用下 ,脱落细胞中PAI 2的表达明显增加 ,凋亡细胞的数量增多 ,PAI 2在凋亡细胞中的表达也增强 ,而在一些胞体较大、形态呈多角形的凋亡细胞中PAI 2表达的增加更为明显。结论 在高度分化的表皮角质形成细胞中 ,TNF α可促进PAI 2的表达并可诱导凋亡的产生 ,就与KC凋亡的关系而言 ,TNF α所诱导的PAI 2可分为两种 ,一种与KC凋亡有关 ,另一种与KC凋亡无关。

烫伤创面再上皮化过程中表皮角质形成细胞增殖分化相关基因差异性表达研究

目的：利用基因芯片技术检测创面再上皮化过程中表皮角质形成细胞(Kerationocytes,KCs)增殖分化相关基因的表达。方法：SD大鼠24只,随机平均分成四组,水浴法造成背部45cm^2深Ⅱ度烫伤,按照基因表达检测时间随机分为4组,每组6只。伤后3、10、14d取创缘1cm皮肤标本；创面完成再上皮化日,取创面中心皮肤标本,制备KCs悬液,另取6只SD大鼠背部皮肤作为正常对照组。检测再上皮化不同阶段KCs增殖分化相关基因的差异性表达。结果：再上皮化过程中cyclin-dependent kinase 2(Cdk2)β,cell division cycle 42 homolog (Cdc42),transcriptional regulator protein(Hcngp),cyclin B(Ccnbl)等增殖相关基因上调,bromodomain contai- ning 4(Brd4),mitogen activated protein kinase 3(Mapk3),mitogen activated protein kinase 8 interacting protein (Mapk8ip)等增殖相关基因下调；完成再上皮化时,增殖、分化相关上调基因中出现protein kinase C,delta (Prkcd)、Caspase3(Casp3)等。结论：KCs在烫伤后活化,MAPK信号转导通路激活,Cdk2β、Cdc42、Hcngp、Cc- nbl等增殖促进因子基因表达上调,使细胞开始增殖；再上皮化过程中,既有增殖相关基因上调,又有下调；完成再上皮化时,Prkcd、Casp3等基因表达上调,调节KCs的增殖和分化。

表皮角质形成细胞分化中tPA分泌的研究

目的 探讨表皮角质形成细胞中 ,tPA分泌的变化及其对细胞分化的影响。方法 利用免疫细胞化学、酶联免疫吸附测定等方法 ,检测高浓度Ca2 + 作用下 ,培养的小鼠分化表皮角质形成细胞表面及培养上清中tPA表达的变化。结果 高Ca2 + 浓度下 ,KC分化标记物K10在培养 2 4h即有较强的表达 ,与此同时 ,在培养上清中检测到大量分泌tPA ;培养 2 4h以后 ,随着培养时间的延长 ,KC培养上清中分泌tPA的含量呈现出降低趋势 ,KC表面tPA量则呈现出增加趋势 ,当有L 精氨酸存在时 ,上述两种趋势均明显减弱。结论 小鼠表皮KC分化过程中存在tPA的分泌 ,分泌tPA能通过其赖氨酸位点进一步吸附于KC表面 。

中药育发液对表皮角质形成细胞体外增殖作用的影响

目的研究中药育发液对表皮角质形成细胞（HEK）的体外增殖作用的影响。方法以章光101育发液为阳性药，通过用酶消化法培养HEK，观察形态，采用MTF法测定细胞生长活力，绘制各组细胞的生长曲线，以评价中药育发液对HEK体外增殖作用的影响。结果与空白对照组比较，给药24h后．中药育发液组细咆数量增多，细胞间有部分相互连接，胞浆内没有透明空泡，细胞体积均匀，细胞生长状态良好；MTF结果显示，中药育发液各剂量组的OD值显著升高（P〈0．01），且对表皮角质形成细胞增殖的促进率均在40％以上。结论中药育发液各剂量组在体外可显著促进HEK的增殖。

不同取皮法对白癜风自体移植表皮角质形成细胞的影响探究

目的分析采用切削取皮以及负压吸疱两种不同取皮方法对白癜风患者自体移植的表皮角质形成细胞所产生的影响。方法对经过免疫化验为稳定期的30例白癜风患者．为观察组．分为单纯切削组、单纯吸疱组以及同时采用两种方式组。并选取10例正常皮肤作为对照组。分析其自体表皮的CASPASE-3以及PCNA表达状况。结果切制纽以及负压吸疱纽取皮在阳性表达率中存在着显著差异（P〈O．05），而跟正常皮肤比较阳性表达率，切削组不存在显著差异（P〉O．05），负压吸疱组存在显著差异（P〈O．05）。切削组以及负压吸疱组跟正常皮肤比较阳性表达率，均不存在显著差异（P〉O．05）。结论对于移植表皮来说，表皮细胞的增殖功能能起到促进成活的作用，同时，采用切削取皮法，对角质形成细胞增殖功能的影响比负压吸疱法小．值得推广应用。

氨基糖甙类体外抑制人表皮角质形成细胞tRNA的生物合成过程

病原体对抗生素逐步增长的耐药现象以及缺乏强效的抗菌药成为感染性疾病治疗中的主要问题，因而有必要进一步了解抗生素在分子水平上的作用机制。以往的证据表明RNA是抗细菌和抗病毒药作用的关键靶点，而氨基糖甙类抗生素除了可以抑制病原体的核糖体功能，抑制蛋白质合成，还有报道可干扰各种RNA分子并在体外能抑制人角质形成细胞的增殖。

不同分子量羧甲基壳聚糖的制备及其对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞生长的影响

本实验将高分子量壳聚糖通过酸水解法和氧化法降解成不同分子量,然后将其羧甲基化制备成相应不同分子量的羧甲基壳聚糖。分别以bFGF和EGF为对照,通过显微观察法和MTT细胞计数法研究不同分子量的羧甲基壳聚糖对小鼠皮肤成纤维细胞和人皮肤表皮角质形成细胞形态及细胞生长的影响。实验结果表明:不同分子量的羧甲基壳聚糖在浓度为1～1 000 ppm时对成纤维细胞和表皮角质形成细胞生长均有促进作用,在浓度为100 ppm时促进作用最强;其促进作用随着分子量的减小而增强,分子量为3 KD左右的羧甲基壳聚糖对成纤维细胞和表皮角质形成细胞生长促进作用最为显著,分别与bFGF和EGF促生长作用基本相当。

埃及伊蚊表皮结构基因AaCPR100A序列特征和表达特性分析

Aa CPR100A是本实验室从埃及伊蚊RNAseq数据库中获得的预测与表皮结构相关的基因。本文拟通过生物信息学和分子生物学技术,探究埃及伊蚊表皮Aa CPR100A基因的序列特点,并分析其在埃及伊蚊的时空表达特征。埃及伊蚊表皮Aa CPR100A蛋白序列Aa CPR100A ORF长度为765 bp,编码254个氨基酸,蛋白分子量约为28.6 k Da,1~16位氨基酸残基为信号肽,其氨基酸序列中含有表皮蛋白CPR家族中的RR-1基序。埃及伊蚊与白纹伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊和黑腹果蝇的氨基酸同源性分别为95%、72%、61%、54%。qRT-PCR结果显示Aa CPR00A基因在表皮和卵期表达量最高,并随发育阶段呈现显著递减变化。结果表明,埃及伊蚊Aa CPR100A表达具有时空和组织特异性特征。

纳米金/壳聚糖仿生功能支架对角质形成细胞贴壁及增殖的影响

背景:许多研究发现三维结构的纳米材料能促进细胞增殖。目的:构建一种新型纳米金/壳聚糖仿生功能支架,观察角质形成细胞在支架上的贴壁、增殖情况。设计、时间及地点:细胞观察性实验,于2006-05/2007-04在南通大学公共卫生学院进行。材料:1.0～2.0d龄SD大鼠由南通大学实验动物中心提供,壳聚糖(脱乙酰度>90%)由浙江省玉环县化工厂提供,氯金酸由上海试剂一厂提供。方法:用化学还原法制备纳米金胶,通过自组装技术将纳米金胶组装到壳聚糖膜表面,得到纳米金/壳聚糖膜仿生功能支架。将SD大鼠皮肤用2.5g/L胰酶消化得到角质形成细胞。将角质形成细胞分别接种在纳米金/壳聚糖仿生功能支架、壳聚糖膜、空白培养板上,计算培养6,12,24h后的贴壁率,用免疫组织化学和透射电子显微镜等手段对培养的角质形成细胞进行鉴定。主要观察指标:角质形成细胞在纳米金/壳聚糖膜上的的贴壁率;纳米金/壳聚糖膜上的角质形成细胞形态。结果:①6,12,24h角质形成细胞在纳米金/壳聚糖仿生功能支架上的贴壁率分别为25.52%,40.34%,58.72%,12,24h贴壁率明显高于其他两组。②免疫组织化学检测结果显示培养的细胞绝大部分为角质形成细胞。③透射电子显微镜观察可以看到角质形成细胞呈圆形,核大,异染色质较多,胞浆内富含线粒体,细胞活力强。结论:纳米金/壳聚糖仿生功能支架能显著提高角质形成细胞的贴壁、生长。

神经酰胺诱导培养角质形成细胞分化的实验研究

目的 : 观察神经酰胺对无血清培养角质形成细胞分化的影响。方法 : 选择两种神经酰胺(C2和C6 ) ,分别添加于无血清培养的角质形成细胞培养液中 ,并在添加后 0、3、6、12、2 4h分别回收总RNA ,用逆转录PCR(RT PCR)方法 ,检测角质形成细胞分化的特异性标记 :TGase1、IVL、KRT1、KRT10等mRNA表达情况。结果 : 神经酰胺添加后 ,C2 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达在 12小时均明显上升 ,在 2 4小时分别升高达阴性对照的 5 .7倍和 5 .2倍 ;但C2 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达升高不明显。C6 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达大致与C2 神经酰胺相似 ,只是2 4小时表达比C2 神经酰胺降低 ,分别为阴性对照的 3.3倍和 3.5倍 ;但C6 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达显著高于C2 神经酰胺 ,2 4小时分别高达 5 .4倍和 10倍。结论 : 神经酰胺能明显升高无血清培养的角质形成细胞对分化特异性标记蛋白mRNA的表达 ,诱导角质形成细胞的分化。

EGF对小鼠角质形成细胞中组织型纤溶酶原激活剂表达的调节

目的 探讨小鼠表皮角质形成细胞 (KC)中 ,EGF对组织型纤溶酶原激活剂 (tPA)表达的影响。方法 应用免疫组化及原位杂交技术 ,结合图像分析 ,定性及定量检测在EGF作用下的小鼠表皮角质形成细胞中 ,tPAmRNA/蛋白质的表达。结果 小鼠表皮KC经EGF处理 12、2 4、48、72h后 ,tPAmRNA/蛋白质的量均增加 (P <0 .0 1) ,tPAmRNA表达的高峰出现于EGF作用 2 4h时 ,tPA蛋白质表达的高峰则出现于EGF作用 48h时。EGF联合 0 .5、1.0、1.5mmol/LCa2 + 作用小鼠表皮KC 48h ,与EGF单独作用小鼠表皮KC 48h时 ,tPAmRNA/蛋白质的表达 ,均显著降低 (P <0 .0 0 1)。结论 小鼠表皮KC中 ,EGF可以时间依赖方式促进tPAmR NA/蛋白质的表达 ,但受Ca2 + 浓度的影响。