黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白编码序列第14和16外显子中单核苷酸多态性研究

背景与目的单核苷酸多态性(SNPs)在蛋白编码序列中多以富集成簇的方式分布,并提示其可能有民族区域和人种之间的差异性,然而SNPs在黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白(prepro EGF)编码序列第14和16外显子中的分布状况迄今尚未见报道,本研究拟对35例黔西南汉族受试者进行研究,旨在分析SNPs在prepro EGF编码序列第14和16外显子中的分布特征。方法设计合成4条引物,分别对35例汉族受试者prepro EGF编码序列第14和16外显子区段进行PCR扩增和产物的DNA测序;检索单核苷酸多态性资料库(db SNP)获取资料并与测序结果进行对比分析。结果 35例黔西南汉族受试者中13例(37.1%)在prepro EGF编码序列的2 525 bp位点出现SNPs,基因型为AG和GG,频率分别为69.2%和30.8%,其等位基因频率分别为A 34.6%和G 65.4%;27例(77.1%)在2 576 bp位点有SNPs,基因型为AA和AG,频率分别为66.7%和33.3%,等位基因频率分别为A 83.3%和G 16.7%。相比之下,北京汉族受试者较黔西南汉族受试者在prepro EGF编码序列第14外显子内多了1个单核苷酸多态位点,即2 619 bp位点;欧美等其他民族不仅在prepro EGF编码序列第14外显子内分布有rs199935855等7个SNPs,而且在其第16外显子内也分布有rs149396988等6个SNPs;黔西南汉族和北京汉族受试者在prepro EGF编码序列的第16外显子内均未见有SNPs分布。结论在黔西南汉族、北京汉族和欧美等民族的prepro EGF编码序列第14和16外显子中,SNPs分别具有各民族、各种族的特征性分布,据此可区分不同地域的种族和人群,甚至进行个体识别。也可将这些呈特征性分布的SNPs视为遗传标记进而深入研究SNPs与疾病发生的关系。

急性心力衰竭患者血清胰岛素样生长因子结合蛋白-7、沉默信息调节因子4表达水平及意义

目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)、沉默信息调节因子4(SIRT4)在急性心力衰竭(AHF)患者血清中的表达水平及其对预后的预测价值。方法 选取151例AHF患者(AHF组)和151例健康体检者(对照组)作为研究对象,检测并比较2组血清IGFBP-7、SIRT4、N-末端钠尿肽前体(NT-proBNP)和活性氧(ROS)水平。分析血清IGFBP-7、SIRT4、NT-proBNP、ROS水平与病情分级的关系;采用Pearson相关系数法分析IGFBP-7、SIRT4与NT-proBNP、ROS的相关性;采用多因素Logistic回归分析法分析AHF患者预后的影响因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析血清IGFBP-7、SIRT4对AHF患者预后不良的预测效能。结果 AHF组血清IGFBP-7、SIRT4、NT-proBNP和ROS水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);AHF组患者中,病情分级Ⅳ级者血清IGFBP-7、SIRT4、NT-proBNP和ROS水平高于Ⅲ级者和Ⅱ级者,且Ⅲ级者高于Ⅱ级者,差异有统计学意义(P<0.05);AHF组预后不良者病情分级和血清IGFBP-7、SIRT4、NT-proBNP、ROS表达水平均高于预后良好者,差异有统计学意义(P<0.05)。AHF患者血清IGFBP-7、SIRT4水平均分别与血清NT-proBNP、ROS水平呈正相关(r=0.523、0.498、0.578、0.557,P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,病情分级和血清IGFBP-7、SIRT4、NT-proBNP、ROS水平均为AHF患者预后的独立影响因素(P<0.05)。ROC曲线显示,血清IGFBP-7、SIRT4对AHF患者预后均有一定预测价值,曲线下面积(AUC)分别为0.794、0.795,且两者与ROS联用的预测价值更高,AUC为0.909(95%CI:0.858~0.959)。结论 IGFBP-7、SIRT4在AHF患者血清中呈高表达,且其表达水平与患者病情分级和预后显著相关,两者联合检测对患者预后具有较高的预测价值。

埃兹蛋白477位酪氨酸的磷酸化在神经生长因子前体促进乳腺癌细胞侵袭中起关键作用

目的研究神经生长因子前体(precursor of nerve growth factor,pro NGF)促进乳腺癌细胞侵袭的作用与埃兹蛋白(ezrin)表达水平及其567位苏氨酸(Thr567)和477位酪氨酸(Tyr477)的磷酸化的相互关系。方法用梯度浓度的pro NGF(0、2.5、5和10 ng/m L)刺激人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,用Transwell侵袭实验检测pro NGF对MDA-MB-231和MCF-7侵袭的影响;用免疫印迹法检测ezrin蛋白的表达水平,ezrin Thr567和ezrin Tyr477磷酸化水平的变化;在MDA-MB-231中转染p Enter-His-ezrin Y477F质粒(ezrin显性负突变质粒),研究ezrin Tyr477磷酸化在pro NGF促进乳腺癌细胞侵袭中的作用。结果pro NGF以浓度依赖的方式促进MDA-MB-231和MCF-7的侵袭(P<0.05);pro NGF以浓度依赖和时间依赖的方式显著升高ezrin Tyr477磷酸化,而对ezrin蛋白的表达以及其Thr567磷酸化无明显影响;Src激酶特异抑制剂SKI-606显著抑制pro NGF对ezrin Tyr477磷酸化的促进作用;转染p Enter-His-ezrin Y477F抑制pro NGF对MDA-MB-231细胞ezrin Tyr477磷酸化和侵袭能力的促进作用(P<0.05)。结论 ezrin Tyr477磷酸化在pro NGF促进乳腺癌细胞侵袭中起关键作用;pro NGF通过激活Src激酶使ezrin Tyr477发生磷酸化。

神经生长因子及其前体蛋白在晚期胰腺癌组织中的表达研究

采用2011年1月-2014年6月在云南省第一人民医院确诊并行手术治疗的58例胰腺癌患者,切除部分肿瘤组织作为实验标本,癌旁组织作为对照,利用免疫组化及Western blot检测晚期胰腺癌组织内神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及神经生长因子前体(precursor of nerve growth factor,pro NGF)的表达,Gel-Pro analyzer 4图像分析系统分析Western条带密度.试验重复3次,取3次IOD值行统计学分析.免疫组化及Western blot结果显示肿瘤组织NGF的表达较癌旁组织明显增高,而pro NGF的表达较癌旁组织明显降低.半定量Western blot显示癌旁组织和肿瘤组织NGF表达的IOD值分别为113.33±8.54和285.00±15.13,pro NGF表达的IOD值分别为245.00±7.55和86.33±7.37,差异有统计学意义(P<0.05).因此,晚期胰腺癌患者肿瘤组织内NGF/pro NGF的比例发生改变,组织内NGF蓄积,而pro NGF减少,这可能是导致胰腺癌肿瘤细胞凋亡减少,生长、浸润和迁徙功能增强的重要机制之一.

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的:构建含有人胰岛素样生长因子(humaninsulin-likegrowthfactor-1,hIGF-1)前体编码全长cDNA的重组载体,使其在E.coliBL21(DE3)中表达,并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化,同时探讨其抗原性及应用价值。方法:采用PCR法,扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a(+)/hIGF-1重组载体,然后将其转化入BL21(DE3)中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Westernblot法检测重组蛋白的抗原活性。结果:重组质粒pET32a(+)/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21(DE3)表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示,其表达量占细菌总蛋白量的25%左右,该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90%以上。Westernblot结果显示非常清晰的免疫印迹条带,表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论:pET32a(+)/hIGF-1重组载体构建成功,并能够高效表达。

胰岛素样生长因子-1减少胎羊缺血性脑白质损伤后淀粉样前体蛋白表达(英文)

目的 淀粉样前体蛋白 (β APP)是脑白质损伤早期敏感的指标 ,并参与缺氧缺血性脑损伤机制。本研究观察胎羊缺血性脑白质损伤及胰岛素样生长因子 1(IGF 1)治疗对淀粉样前体蛋白 (β APP)表达的影响。方法 胎羊于胎龄 117 12 4天 (足月为 14 7天 )时通过双侧颈动脉阻塞 30min造成双侧脑缺血损伤 ,损伤后胎羊随机分为损伤组 (n =8)和重组人IGF 1(rhIGF 1)治疗组 (n =9) ;另设正常对照组 (n =5 ) ,为假手术动物。治疗组缺血后 90min经侧脑室注射 3μgrhIGF 1;损伤组经侧脑室注射等量人工脑脊液。缺血损伤后 96h结束实验 ,处死动物 ,取出胎羊 ,固定脑组织。免疫组化法检测脑白质胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)、β APP阳性细胞及白质内髓鞘碱性蛋白 (MBP)密度。应用免疫荧光双标记观察APP表达阳性细胞。结果 与正常对照组 (2 7.8± 4 .8)比较 ,缺血损伤组MBP密度 (4.7± 7.1,P <0 .0 0 1)明显减少。正常对照组未见 β APP阳性细胞 ,损伤后阳性细胞数明显增加 (49.6± 2 3.7,P <0 .0 0 1) ,rhIGF 1治疗可减少 β APP阳性细胞数 (17.9± 16 .5 ,P <0 .0 1)。免疫荧光双标记显示部分细胞为 β APP GFAP双标阳性细胞。 结论 胎羊缺血性脑白质损伤可导致星形胶质细胞表达β APP ,β APP表达增加可能与脑损伤有关?

胰岛素样生长因子结合蛋白-7在急性心力衰竭所致呼吸困难诊断中的应用

目的探讨血浆胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP7)以及IGFBP7联合N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)在急性心力衰竭所致呼吸困难中的诊断价值。方法选取2018年3月至2020年9月中国医科大学附属第一医院急诊科就诊的154例急性呼吸困难患者为研究对象,根据临床诊断结果,将患者分为非急性心力衰竭组(n=93)和急性心力衰竭组(n=61)。2组患者均进行血常规,肝、肾功能,胸部X线片、心电图和超声心动图检查及左心室射血分数(LVEF)、血浆IGFBP7和NT-proBNP水平检测。采用t检验或χ2检验比较2组各项临床指标的差异,对有统计学意义(P<0.05)指标采用logistic回归分析急性心力衰竭的危险因素。采用受试者操作特征(ROC)曲线分析IGFBP7、NT-proBNP以及二者联合对急性心力衰竭患者呼吸困难的诊断价值。结果与非急性心力衰竭组比较,急性心力衰竭组患者合并高血压、冠状动脉疾病、心房颤动比例,血浆IGFBP7和NT-proBNP水平显著增高,而合并哮喘/慢性阻塞性肺疾病(COPD)比例、LVEF和肾小球滤过率估算值(eGFR)则显著降低(均P<0.05)。logistic回归分析结果显示,IGFBP7、NT-proBNP升高及LVEF降低是急性心力衰竭的危险因素(均P<0.05)。ROC曲线分析表明,IGFBP7的ROC曲线曲线下面积(AUC)为0.878(0.821~0.935)。IGFBP7最佳截断值为98.4 ng/mL,诊断心力衰竭性呼吸困难的灵敏度为85.2%,特异度为82.8%。NT-proBNP的ROC曲线AUC为0.879(0.818~0.940)。NT-proBNP的最佳截断值为1366 ng/L,诊断心力衰竭性呼吸困难的灵敏度为85.2%,特异度为89.2%。二者联合诊断的AUC为0.952(0.918~0.986),灵敏度为88.5%,特异度92.5%。结论单独使用IGFBP7或联合NT-proBNP是诊断急性心力衰竭所致呼吸困难的有效方法,IGFBP7可作为一种新型的急性心力衰竭的生物学标志物。

胰岛素样生长因子-1对β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE1)的影响以及可能的细胞信号机制。方法:用不同剂量IGF-1(20、40 ng/ml和80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,荧光定量PCR及Western blot检测BACE-1mRNA及蛋白水平;Western blot检测淀粉样前体蛋白、C99、C83及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine threonine kinase,PI3-K/Akt)通路相关蛋白的水平;ELISA检测细胞培养液中β-淀粉样蛋白42(β-amyloid peptide,Aβ42)的水平,然后选择最佳剂量的IGF-1(80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在此之前30 min加入PI3-K抑制剂LY294002(25μmol/L及50μmol/L),重复上述检测。结果:IGF-1降低BACE-1、C99及Aβ42的水平(P=0.000),提高C83的表达(P=0.000),增加Akt的磷酸化(P=0.000),而LY294002具有抑制IGF-1的上述作用。结论:IGF-1降低BACE-1mRNA及蛋白的水平,其机制可能涉及PI3-K/Akt信号通路。

西妥昔单抗对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡、胶质细胞活化及脑组织淀粉样前体蛋白表达的影响

目的:探讨西妥昔单抗对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡、胶质细胞活化及脑组织淀粉样前体蛋白(APP)表达的影响。方法:27只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、西妥昔单抗组,每组9只。结扎大脑中动脉制备缺血再灌注模型,立即经侧脑室注射给予西妥昔单抗(106μg/d),持续7 d。每组选取3只,在术后第3和7天进行神经功能评分。每组分别在缺血再灌注术后第3和7天处死3只,取脑组织制备冰冻切片,用免疫荧光染色观察APP及胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,用TUNEL染色法检测神经元凋亡指数。提取新生大鼠大脑皮层组织制备胶质细胞悬液,培养的胶质细胞换成含有西妥昔单抗(10μg/mL)的无糖无血清培养基在缺氧培养箱中培养2 h,然后换成正常糖/血清的培养基在正常氧的培养箱中继续培养6 h,收集细胞,观察胶质细胞GFAP荧光强度的变化,对照组不进行缺氧/复氧处理,缺氧/复氧组不加西妥昔单抗。结果:与假手术组比较,缺血再灌注组大鼠神经功能评分升高,凋亡指数增加,胶质细胞GFAP免疫荧光强度增强,APP表达升高(P<0.05)。与缺血再灌注组相比,西妥昔单抗组神经功能评分下降,凋亡指数降低,GFAP免疫荧光强度减弱,APP表达下降(P<0.05)。体外实验结果显示,与对照组比较,缺氧/复氧组胶质细胞GFAP免疫荧光强度增强,而西妥昔单抗组较缺氧/复氧组降低(P<0.05)。结论:西妥昔单抗能促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复,其机制可能与减少APP的表达、抑制神经元凋亡及胶质细胞活化有关。

神经生长因子前体蛋白在糖尿病视网膜神经细胞病变中的作用

糖尿病视网膜神经细胞病变(DR)是糖尿病的主要周围神经组织病变。许多研究表明它发生在视网膜微血管病变之前,其受累的视网膜神经节细胞、神经胶质细胞、视锥视杆细胞等发生损伤和死亡,是最终导致糖尿病患者视力损伤的重要因素之一。DR已成为目前全球主要的致盲眼病之一。神经生长因子前体蛋白(proNGF)能与其凋亡受体p75神经营养因子受体(p75NTR)结合,对细胞的生长具有抑制作用,并介导细胞凋亡。研究证实,proNGF在DR中扮演了重要作用。本文现就proNGF及其受体p75NTR在糖尿病视网膜神经细胞病变的作用作一综述。

胃癌前病变大鼠模型胃黏膜细胞凋亡及表皮生长因子受体、神经丝蛋白200、表面抗原分化因子受体2蛋白表达的意义

目的探讨胃癌前病变大鼠模型胃黏膜细胞凋亡及表皮生长因子受体(EGFR),神经丝蛋白200(NF-200),表面抗原分化因子受体2(C-erb-2)蛋白表达的意义。方法60只Wistar大鼠通过随机数表法分作模型组和对照组,每组各30只。模型组采用甲基硝基亚硝基胍干预90 d,建立胃癌前病变大鼠模型。对照组予以同等剂量的蒸馏水灌胃处理。分析两组大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡率,胃黏膜EGFR、NF-200及C-erb-2蛋白表达情况,并以Pearson相关性分析。此外,通过受试者工作特征(ROC)曲线明确EGFR、NF-200及C-erb-2蛋白诊断胃癌前病变的效能。计量资料组间比较采用成组t检验。结果模型组大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡率明显高于对照组[(37.22±0.49)%比(1.12±0.03)%],差异有统计学意义(t=402.772,P<0.05)。模型组大鼠胃黏膜EGFR、C-erb-2蛋白表达水平高于对照组(278.31±32.84、86.03±7.15比181.37±21.34、33.05±5.32),而NF-200蛋白表达水平低于对照组(0.71±0.03比1.00±0.00),差异均有统计学意义(t=13.557、52.947、32.561,P<0.05)。经Pearson相关性分析可得:胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡率和EGFR、C-erb-2蛋白表达水平均呈正相关(r=0.623、0.605,P<0.05),与NF-200蛋白表达水平呈负相关(r=-0.617,P<0.05)。结论胃癌前病变大鼠模型胃黏膜细胞凋亡明显,且联合检测EGFR、C-erb-2及NF-200蛋白表达有助于胃癌前病变的早期诊断。

晚期非小细胞肺癌患者纤维蛋白原、D二聚体与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂疗效的关系

目的探讨晚期非小细胞肺癌患者纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效的关系。方法回顾性分析44例EGFR敏感突变的晚期非小细胞肺癌患者的临床资料,评估FIB、D-D与疗效的关系;绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算二者预测TKI耐药的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度。结果FIB≤498 mg/dl组、D-D≤0.55μg/ml组患者中位无进展生存时间(PFS)分别长于FIB﹥498 mg/dl组、D-D﹥0.55μg/ml组患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。D-D水平与TKI耐药的一致性较高,能较好地预测TKI耐药的发生,AUC=0.83,P﹤0.01,灵敏度为87.1%,特异度为76.9%,诊断符合率为84.1%,约登指数为0.64。结论FIB、D-D对肺癌靶向治疗有较好的预测作用。

人巨细胞病毒诱导分化中的神经干细胞分泌神经生长因子前体

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染对人神经干细胞(neural stem cells,NSC)向星形胶质细胞分化过程中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及其受体p75NTR、trkA表达的影响,为阐明HCMV感染致NSC损伤的分子机制提供理论依据。方法体外培养人海马NSC,感染组以感染复数(multiplicity of infectin,MOI)为5的HCMVAD169株感染NSC,对照组只加入与病毒悬液等体积的培养液,在感染病毒的同时,诱导感染组和对照组NSC向星形胶质细胞分化,分别在感染后0、1、3、5、7、9 d收获细胞,用RT-PCR、免疫荧光和Western blot方法检测细胞内NGF及其受体p75NTR、trkA的转录水平和蛋白表达水平。结果对照组NSC不表达NGF及其受体P75NTR和trkA。感染组细胞在第3天开始出现NGFmRNA的表达,第5天出现P75NTRmRNA的表达,且其表达强度随时间增强;第5天出现相对分子质量为40000和100000NGF前体蛋白(ProNGF)和P75NTR蛋白,随时间延长,表达强度升高。免疫荧光检测显示,NGF前体蛋白位于细胞的细胞质;整个感染过程中未检测到trkA的表达。结论 HCMV感染可诱导向星形胶质细胞分化的海马NSC分泌NGF前体蛋白及其受体p75NTR。

抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究

目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体，用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备ＥＱ７５、ＣＹ１２．１４单克隆抗体细胞株的基础上，通过杂交杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）的ＩＣ５０分别为１０－９．６、１０－８．４ｍｏｌ／Ｌ。结论：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１），以ＩＣ５０值计算，有效率为单用皂角毒的１５倍左右。

表皮生长因子与胰岛素对小鼠早胚体外发育的影响(英文)

目的:探讨表皮生长因子(epiderm algrowth factor,EGF)与胰岛素对小鼠体外受精(in vitro fertilization,IVF)胚胎植入前发育的影响。方法:小鼠IVF胚胎培养在添加不同浓度的EGF和/或胰岛素-葡萄糖的CZB培养基中,于hCG注射后138h检测囊胚发育率及每个囊胚的细胞数目。结果:培养基中添加0.1ng/mlEGF显著提高了小鼠扩张囊胚的形成率,而囊胚的细胞数目并未增加。EGF与胰岛素-葡萄糖共同添加对小鼠IVF囊胚发育率及囊胚细胞数目并未有显著提高。结论:EGF通过刺激细胞分化,而非细胞增殖方式促进小鼠IVF胚胎的早期发育。而各自最佳浓度的EGF与胰岛素共同添加对小鼠早胚并未有协同促进作用。

表皮生长因子协同体预处理对大鼠脑缺血再灌注的保护作用

目的探讨表皮生长因子协同体(EGF-c)预处理对大鼠脑缺血再灌注(IR)的保护作用及其相关机制。方法将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR组)及EGF-c预处理+IR组(EGF-c组)。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)。术后24 h,应用2%氯代三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达。结果与sham组比较,IR组脑梗死体积增大(P <0.01),SOD活性降低(P <0.01),MDA和HMGB1的含量增加(P <0.01)。与IR组比较,EGF-c组脑梗死体积减小(P <0.05),SOD活性上升(P <0.01),MDA含量下降(P <0.01),HMGB1的表达量下降(P <0.05)。结论 EGF-c预处理可能通过改善脑组织SOD活性、降低MDA含量、下调HMGB1的表达从而对大鼠IR起到保护作用。

胃癌血清标志物与人表皮生长因子受体2、Ki-67表达及临床病理特征的关系

目的探讨胃癌病人手术前血清标志物癌胚抗原、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)表达与人表皮生长因子受体2(HER-2)和Ki-67蛋白表达水平相关性以及与临床病理特征之间的关系。方法首先收取132例自2017年10月至2018年12月来安徽医科大学第一附属医院高新院区住院治疗的胃癌手术病人的术前血液标本和肿瘤组织标本,然后用免疫法检测胃癌病人术前血清标志物癌胚抗原,CA125,CA19-9的表达情况,用免疫组织化学Elivision法检测同一病人术后肿瘤组织HER-2和Ki-67蛋白表达情况,最后分析标志物癌胚抗原,CA125,CA19-9与HER-2,Ki-67的相关性,以及与临床病理特征的相关性。结果132例胃癌病人血液中发现超出正常值的癌胚抗原为46例(34.8%),CA125为20例(15.2%),CA19-9为14例(10.6%),免疫组织化学结果发现HER-2表达(0)为49例(37.2%),(+)为46例(34.8%),(2+)为21例(15.9%),(3+)为16例(12.1%),癌胚抗原超出正常值的阳性表达与HER-2表达无相关性(Z=−1.356,P=0.175),CA125和CA19-9的阳性表达与HER-2表达有关(Z=−2.183,P=0.029;Z=−2.379,P=0.017);Ki-67表达阴性2例(1.5%),弱阳性1例(0.8%),中度阳性63例(47.7%),阳性66例(50%),HER-2表达与Ki-67表达呈负相关(rs=−0.274,P=0.007);同时癌胚抗原阳性与胃癌病人年龄、肿瘤大小以及肿瘤分期有关(P=0.016,P=0.046和P=0.030),CA125与脉管侵犯有关(P=0.026)。结论术前血清CA125、CA19-9与术后HER-2蛋白在胃癌中表达有关,HER-2表达与Ki-67表达呈负相关。相关血清癌胚抗原阳性与胃癌病人年龄、肿瘤大小、肿瘤分期相关,CA125与脉管侵犯有关。

黑色素前体多巴和多巴胺培养后的中华按蚊蛹体壁结构特征及其转录组分析

【目的】筛选出促黑化条件下中华按蚊Anopheles sinensis蛹体壁中表达变化最显著的基因类群,并初步探究它们与黑色素前体累积及表皮结构特征间的相关性。【方法】在Grace’s昆虫细胞培养基中添加黑色素前体多巴(dopa)和多巴胺(dopamine),对化蛹20 min内中华按蚊体壁进行体外培养,对照组(CK)中不添加黑色素前体,培养16 h时利用体视显微镜观察黑色素前体处理组与对照组蛹体壁着色和表皮截面特征;通过Illumina测序平台对黑色素前体处理组与对照组蛹体壁进行转录组测序,对差异表达基因(different expression genes,DEGs)进行GO功能分类和KEGG通路富集分析;分析被显著富集的基因注释和染色体分布;利用qRT-PCR验证转录组数据。【结果】多巴和多巴胺处理组中华按蚊蛹体壁与表皮截面相比于CK明显黑化,且多巴处理组着色程度最深;多巴和多巴胺处理组中华按蚊蛹表皮相比于CK明显增厚,且增厚程度与黑化程度相关。多巴处理组vs CK与多巴胺处理组vs CK比较组的DEGs分别为2952和697个,且下调基因居多;这两类比较组间共有上调的DEGs有223个,共有下调的DEGs有347个。DEGs的GO功能注释结果表明,在上述比较组以及两比较组间共有的上调DEGs被显著富集到表皮结构组分(GO:0042302)。KEGG通路富集分析结果显示,多巴处理组vs CK比较组上调的DEGs被显著富集到剪切体通路,下调的DEGs被显著富集到Toll-Imd和Hippo信号通路;在多巴胺处理组vs CK比较组中下调DEGs被显著富集到自噬通路;这两比较组间共享的DEGs没有被显著被富集的通路;65个被富集的上调表皮蛋白基因来自于CPR,CPF,TWDL,CPLC和CPAP 5个家族,并分布于3条染色体,其中部分成员成簇分布。qRT-PCR结果显示,两比较组中所选择的共有上调的12个表皮蛋白基因的表达量与转录组数据一致。【结论】本研究在组学水平上证实了蚊虫体壁组织中黑色素的过量累积能够诱导大量表皮蛋白基因的显著上调表达,并使得其表皮结构特征发生改变。研究结果为后续探索黑色素前体对表皮结构基因的调控机制,以及理解昆虫表皮重要组分间的互作模式,对昆虫适应性状的影响提供了新的视角。

家蚕蚕蛹过敏原表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

目的克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体（CPR63）基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因（ref｜NM_001173223.1｜）,将其连接至克隆载体p MD18-T,p MD18-T-CPR63阳性质粒与原核表达载体p ET-44a分别用限制性内切酶酶切,构建出重组表达质粒p ET-44a-CPR63,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达;Western blot检测重组CPR63蛋白特异性过敏原性;用clustalw2和MEGA5工具包进行同源性分析;用Prot Param Tools预测其理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。利用网络服务器IEDB、Preprod和DNAStar,对CPR63蛋白T、B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了家蚕蚕蛹CPR63基因,其开放阅读框549 bp,编码182组氨基酸。通过大肠杆菌E.coli BL21（DE3）表达CPR63重组蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约20 000。Western blot显示重组CPR63能够与家蚕蚕蛹过敏患者血清Ig E结合。家蚕蚕蛹CPR63蛋白与黑脉金斑蝶表皮蛋白RR-2基序63（gb｜EHJ69818.1｜）同源性为85%。系统进化树结果显示家蚕蚕蛹与小菜蛾亲缘关系比较近。理化性质预测显示CPR63蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示CPR63的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列（5～13、20～28、51～59和87～95）。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列（21～40、37～56、47～66和64～83）。结论成功克隆并表达了家蚕蚕蛹CPR63,并证实重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究家蚕蚕蛹过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。