抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28000左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。

嵌合抗原受体表皮生长因子受体Ⅲ型突变体单链抗体-ICOS-CD3ζ表达载体的构建与鉴定

目的 构建嵌合抗原受体表皮生长因子受体Ⅲ型突变体单链抗体（EGFRvⅢscFv）-ICOS-CD3ζ表达载体.方法 将靶向EGFRvⅢscFv（726 bp）与第2代嵌合抗原受体的铰链区、跨膜区、胞内信号区（Hinge-TM-ICOS-CD,648bp）通过重叠延伸聚合酶链反应（PCR）连接,克隆入表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点,测序确定DNA序列正确后脂质体法转染293T细胞,Western blot检测目的基因表达.结果 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和DNA测序显示嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-ICOS-CD3ζ各基因片段连接及序列正确,转染293T细胞48h后提取蛋白质,鼠抗人CDζ单抗免疫印迹显示目的基因为57×103的蛋白条带,与预算相对分子质量相符.结论 成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-ICOS-CD3ζ表达载体,为表达EGFRvⅢ的肿瘤靶向免疫治疗提供了研究基础.

EGFRvⅢ单链抗体治疗小鼠脑胶质瘤的研究

目的探讨表皮生长因子受体III型突变体单链抗体(EGFRvIIIscFv)对小鼠脑胶质瘤的治疗效果。方法人工合成EGFRvIIIscFv基因序列并构建到原核表达载体中,诱导表达重组蛋白,经电泳和western blotting鉴定;再通过纯化和复性,得到有功能的EGFRvIIIscFv;用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定抗体的亲和常数后,通过立体定向仪将其注射到胶质瘤小鼠的脑内,观察荷瘤鼠的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果双酶切鉴定和测序结果证实人工合成的EGFRv Ⅲ scFv序列与基因数据库中完全一致;经过诱导表达,电泳显示重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达;western-blotting鉴定蛋白分子量为63kDa,与预期大小基本一致;该单链抗体亲和常数为0.203×10-8mol/L;将蛋白注射到荷瘤鼠的脑内,与对照组相比,实验组肿瘤VEGF表达量明显减少、荷瘤鼠中位生存期明显延长(P<0.01)。结论 EGFRvscFv重组蛋白可与EGFRvⅢ特异性结合;脑内注射EGFRvⅢscFv可明显降低胶质瘤血管形成,延长荷胶质瘤小鼠生存期。

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ的抗体药物提供了靶向载体分子。

EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响

目的:探讨表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响。方法:应用免疫组织化学染色法检测EGFRvⅢ在60例人脑成胶质细胞瘤及其癌旁正常脑组织中的表达。建立稳定高表达EGFRvⅢ的成胶质细胞瘤A172细胞株,应用细胞计数法、MTT法、细胞克隆形成实验以及裸鼠成瘤实验检测其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响。结果:EGFRvⅢ在脑成胶质细胞瘤组织中的阳性表达率明显高于其癌旁正常脑组织(P<0.01);与转染空载体对照组比较,高表达EGFRvⅢ的A172细胞增殖能力明显增加;对照组和高表达EGFRvⅢ组的细胞克隆数分别为(50±10)个和(140±25)个,差异有统计学意义(P<0.01);高表达EGFRvⅢ组的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量均高于对照组(P<0.01)。结论:EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤组织中高表达,并且可促进成胶质细胞瘤A172细胞的增殖。

靶向制剂＾131I-Anti-EGFRvⅢ的制备及其在恶性胶质瘤裸鼠中的显像分布

目的探讨放射性核素碘131（^131I）标记表皮生长因子受体Ⅲ型突变体抗体（Anti-EGFRvⅢ）的实验方法、条件以及标记产物^131I-Anti-EGFRvⅢ在恶性胶质瘤裸鼠体内的靶向性分布。方法采用Iodogen法进行Anti-EGFRvⅢ的^131I标记，SephadexG-50层析柱层析分离各组分．纸层析法测定标记产物的放射化学纯度及体内、外稳定性。选取肿瘤平均直径在10-15mm的U87-EGFRvⅢ胶质瘤模型裸鼠28只，按随机数字表法分为静脉注射^131I-Anti-EGFRvⅢ组，静脉注射^131I组，瘤内注射^131I-Anti-EGFRvⅢ组，瘤内注射^131I组，每组7只，分别经尾静脉和瘤内注射7．5MBq／0.1mL标记产物^131I-Anti-EGFRvⅢ和^131I,应用单光子发射计算机断层成像术（SPECT）扫描观察标记产物在胶质瘤裸鼠体内的放射性分布特点。结果^131I标记Anti—EGFRvⅢ的标记率为（68．12±6．19）％：纯化后纸层析法测得^131I-Anti—EGFRvⅢ的即刻放射化学纯度为（95．12±0．591％，分别在室温和37℃血清中放置1、2、4、12、24h后放射化学纯度比较差异均无统计学意义（P〉0．05），其中放置24h后放射化学纯度分别为（87．78±5.351％和（85．12±3．581％。SPECT显像扫描显示无论是通过尾静脉注射还是瘤内注射标记产物^131I-Anti-EGFRvⅢ，肿瘤部位均可见较强烈的放射性显像，而甲状腺基本不显像。结论Iodogen法适用于Anti-EGFRvⅢ的^131I标记。标记的产物^131I-Anti-EGFRvⅢ具有良好的放射化学纯度和稳定性，能够与肿瘤组织特异性结合,具有良好的靶向性。