表皮生长因子受体反义RNA抑制胶质瘤细胞生长增殖的体外试验

目的：研究表皮生长因子受体基因对于胶质瘤发生发展的作用，探索以ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ进行反义基因治疗胶质瘤的可行性。方法：将含ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的质粒通过脂质体介导转入Ｃ６恶性胶质瘤细胞，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定外源基因整合情况，ＭＴＴ法测定细胞存活率，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、细胞原位ｍＲＮＡ杂交及ＥＧＦＲ免疫组化染色检测ＥＧＦＲｍＲＮＡ及蛋白表达，核仁组成区相关嗜银蛋白染色（ＡｇＮＯＲ计数）检测细胞增殖活性。结果：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明外源性反义ＥＧＦＲ基因（互补于ＥＧＦＲ基因全长及３端部分序列）分别在Ｃ６细胞中整合（分别命名为Ｃ－ｐＲ１和Ｃ－ｐＲ３），通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、原位杂交及细胞免疫组织化学检测均显示转染ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的Ｃ６细胞比转染前ＥＧＦＲｍＲＮＡ水平及ＥＧＦＲ蛋白水平有不同程度的降低。表达高水平反义ＲＮＡ的克隆在培养状态下细胞增殖活性较对照组有明显下降。结论：ＥＧＦＲ在恶性胶质瘤细胞的发生发展过程中起十分关键的作用，ＥＧＦＲ有可能成为基因治疗恶性胶质瘤的优选靶的之一。

肺腺癌长链非编码RNA表皮生长因子受体-反义RNA 1的表达水平与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗有效率及预后的关系

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)表皮生长因子受体(EGFR)-反义RNA 1(AS1)的表达水平与EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有效率及预后的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测并比较80例肺腺癌患者的肺腺癌组织和癌旁组织、3组转染PC9细胞(control组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-EGFR-AS1组)、PC9细胞和PC9/GR细胞经吉非替尼培养后lncRNA EGFR-AS1的表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和细胞划痕实验分别检测3组转染PC9细胞的活力和迁移能力。以lncRNA EGFR-AS1表达水平的中位数为分界将肺腺癌患者分为lncRNA EGFR-AS1高表达组和低表达组,比较lncRNA EGFR-AS1高、低表达组患者EGFR-TKI治疗的效果及临床特征、生存情况。采用Cox回归法分析肺腺癌患者预后的影响因素。结果肺腺癌组织和经吉非替尼培养后PC9/GR细胞中lncRNA EGFR-AS1表达水平分别高于癌旁组织和PC9细胞,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。lncRNA EGFR-AS1低表达组患者EGFR-TKI治疗总有效率和中位生存时间均明显高于lncRNA EGFR-AS1高表达组患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。lncRNA EGFR-AS1高、低表达组患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移情况、美国东部肿瘤协作组(ECOG)体力状况评分比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。多因素Cox分析结果显示,TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、lncRNA EGFR-AS1高表达均是肺腺癌患者预后不良的危险因素(P﹤0.05)。pcDNA3.1-EGFR-AS1组PC9细胞中lncRNA EGFR-AS1表达水平、细胞存活率及细胞迁移率均高于control组和pcDNA3.1-NC组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论lncRNA EGFR-AS1参与肺腺癌的发生发展,并且影响患者的预后和EGFR-TKI治疗的有效率。

长链非编码RNA PVT1调控表皮生长因子受体/有丝分裂原活性蛋白激酶通路对卵巢癌细胞的影响实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)人浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)调控表皮生长因子受体(EGFR)/有丝分裂原活性蛋白激酶(MAPK)通路对卵巢癌细胞的影响。方法:将人卵巢癌细胞SKOV-3分为对照组(空白未处理)、si-NC组(转染携带空载体慢病毒)、si-lncRNA PVT1组(转染lncRNA PVT1 siRNA)。另选取人正常卵巢上皮细胞系HOSE为正常组。采用RT-qPCR检测细胞中lncRNA PVT1表达。采用Transwell实验、平板克隆实验分别检测SKOV-3细胞侵袭以及克隆形成能力。采用流式细胞术检测SKOV-3细胞凋亡情况。采用Western blot检测细胞中EGFR、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2蛋白表达。根据细胞分组,将BALB/c裸鼠也相应随机分为对照组、si-NC组、si-lncRNA PVT1组,每组8只。建立裸鼠皮下移植瘤模型。比较各组裸鼠不同时间皮下移植瘤体积及平均瘤体重量。结果:对照组SKOV-3细胞lncRNA PVT1表达水平高于si-lncRNA PVT1组,si-lncRNA PVT1组SKOV-3细胞lncRNA PVT1表达水平高于正常组人卵巢正常上皮细胞系HOSE(均P<0.05)。与对照组及si-NC组比较,si-lncRNA PVT1组SKOV-3细胞克隆形成率、侵袭细胞数、EGFR、p-ERK1/2蛋白表达水平降低,细胞凋亡率升高(均P<0.05)。与对照组及si-NC组比较,si-lncRNA PVT1组裸鼠28 d时皮下移植瘤体积以及平均瘤体重量降低(均P<0.05)。结论:lncRNA PVT1在卵巢癌细胞中高表达,干扰其表达可抑制卵巢癌细胞侵袭、克隆、凋亡以及裸鼠皮下成瘤速度,作用机制可能与调控EGFR/MAPK信号通路有关。

表皮生长因子受体反义RNA联合伽玛刀治疗对胶质瘤细胞生长抑制作用的研究

人表皮生长因子受体（vascularendothelial growth factor，EGFR）的扩增、过表达和突变在胶质瘤的发生、发展中起重要作用，是恶性胶质瘤的重要责任基因之一。

表皮生长因子受体反义RNA体内外抑制C6胶质瘤细胞的研究

我们通过研究EGFR反义mRNA对体内外鼠C6胶质瘤细胞的抑制作用,探讨反义基因治疗的可行性,现报道如下。材料与方法 1 体外试验将含反义EGFRcDNA-3′端部分序列(552bp)的质粒pactQsR3及对照质粒pactQs与含新霉素抗性基因的载体质粒pSV2-neo分别按5∶1比例,以Lipofectamine介导,共转染C6细胞,经G418筛选,14天获两种抗G418阳性克隆,分别称之为C-pR3和C-P,每种挑取6个克隆培养传代。采用South-ern和Northerm印迹杂交,鉴定外源性反义EGFRcD-

表皮生长因子受体反义RNA表达对乳腺癌细胞恶性表型的抑制作用

表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白［１］。为了直接观察ＥＧＦＲ过表达在人类肿瘤中的作用，我们应用反义核酸技术，针对ＥＧＦＲ５′１３５０ｂｐ片段构建了反义ＲＮＡ表达质粒ｐＬＸＳＮＡＥ５′，将其导入人乳腺癌细胞ＭＤＡＭＢ...

RNAi抑制鼻咽癌细胞表皮生长因子受体表达对细胞生长的影响

目的利用RNAi技术抑制鼻咽癌细胞5-8F表皮生长因子受体(EGFR)表达,观察细胞生长变化,探讨EGFR与鼻咽癌发生发展之间的相关性。方法利用体外转录法合成EGFR特异性siRNA,将其瞬时转染5-8F,收集转染后细胞总RNA和蛋白,利用RT-PCR和Westernblot法测定EGFR表达水平的变化,并检测EGFR表达抑制后细胞生长速度和生长周期的变化。结果合成的3对siRNA中,有一对使EGFRmRNA表达下降67．5％,蛋白表达下降77％。EGFR表达抑制后5-8F生长速度减慢,并诱导细胞周期停止在G1期。结论RNAi沉默EGFR表达可抑制鼻咽癌细胞生长,并诱导癌细胞停止在G1期．RNAi可作为探索鼻咽癌发生发展机制和基因治疗的有效工具。

靶向表皮生长因子受体psiRNA抑制人脑胶质瘤细胞系U251生长的体外研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(EGFR)RNA干扰(RNAi)技术抑制人脑胶质瘤细胞系U251EGFR表达后,在体外对细胞增殖活性和侵袭能力的抑制作用。方法应用流式细胞术、Annexin V法、MTT法、Matrigel细胞外基质生长实验和Transwell细胞侵袭实验评价由脂质体Lipofectamine 2000介导转染的人脑胶质瘤细胞系U251转染前后细胞增殖活性和侵袭能力的变化;Western blotting检测EGFR和PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质的表达水平。结果与对照组和psiRNA-scr组比较,psiRNA-EGFR组EGFR以及PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质表达水平降低(均P=0.000)。转染后,psiRNA-EGFR组细胞阻滞于G0和G1期,S期细胞数目减少(均P=0.000);其细胞凋亡率为(9.60±0.26)%,高于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.000);自培养第2天其细胞增殖速率即呈下降趋势,且低于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.001)。结论靶向表皮生长因子受体RNAi技术可以序列特异性地抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞表皮生长因子受体表达,在体外对U251细胞生长具有明显抑制作用。靶向表皮生长因子受体psiRNA基因治疗可能成为脑胶质瘤治疗的新策略。

表皮生长因子受体shRNA对人鼻咽癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的荷瘤裸鼠瘤内注射RNA干扰(RNAi)表皮生长因子受体(EGFR)基因表达载体shRNA-EGFR,探讨其对肿瘤放射敏感性的影响。方法用shRNA-EGFR结合脂质体转染人鼻咽癌细胞系CNE1,收集转染后细胞的总RNA和蛋白质,利用RT-PCR和Western blotting检测EGFR表达水平的变化。用CNE1细胞建立裸鼠肿瘤动物模型,荷瘤裸鼠瘤内注射shRNA-EGFR脂质体混合物,观察肿瘤体积变化。经放射治疗后第16天处死裸鼠剥离瘤体称重,评价其对放射敏感性的影响。结果 shRNA-EGFR成功转染CNE1细胞。RT-PCR和Western blotting检测结果表明shRNA-EGFR可显著下调EGFRmRNA和蛋白质的表达(P<0.05)。shRNA-EGFR联合放射治疗组与对照组、单独放射治疗组、shRNA-EGFR治疗组之间的肿瘤体积变化和质量存在显著性差异(P<0.05)。结论 shRNA-EGFR基因放射治疗能显著抑制鼻咽癌移植瘤的生长,增加其对放射治疗的敏感性。

RNAi技术抑制乳腺癌细胞表皮生长因子受体表达的在体实验研究

目的探讨采用体外化学合成的小干扰RNA(siRNA)结合阳离子脂质体是否能有效在体转染乳腺癌细胞,以期为RNAi的在体实验研究提供实验数据和理论依据。方法(1)建立裸鼠肿瘤动物模型,计算成瘤率。(2)体外转染乳腺癌细胞,常规动物接种,测量肿瘤体积和动物重量,计算肿瘤抑制率。(3)采用免疫组化和Western blotting技术测定肿瘤组织的表皮生长因子受体蛋白水平,采用Real-time PCR检测表皮生长因子受体基因水平,采用ELISA检测动物血清及肿瘤抽提蛋白中EGF含量。结果MDA-MB-231、ZR-75细胞成瘤率依次为30.00%、88.89%,MDA-MB-231细胞的成瘤能力明显弱于ZR-75细胞。ELISA检测结果证实dsRNA-表皮生长因子受体可将血清及肿瘤组织抽提蛋白中的EGF含量分别降低16.77%、12.59%。Real-time PCR结果表明dsRNA-表皮生长因子受体可将表皮生长因子受体基因表达下调21.05%。结论(1)采用体外化学合成的siRNA结合阳离子脂质体可有效在体转染乳腺癌细胞。(2)在体实验中RNAi效应持续的时间明显长于体外实验。(3)针对表皮生长因子受体基因序列设计的siRNA可作为极具开发前途的抗肿瘤新药,其在体实验中触发RNAi可能的作用机制尚需进一步深入探讨。

靶向表皮生长因子受体的小分子RNA干扰抑制人脑胶质瘤Notch1表达的实验研究

目的探讨RNA干扰表皮生长因子受体后Notch1在人脑胶质瘤中的表达变化。方法应用免疫组织化学方法检测不同级别脑胶质瘤组织标本中Notch1的表达水平,并进行相关分析。选择人表皮生长因子受体的两个RNA干扰靶序列构建靶向表皮生长因子受体的RNA干扰表达质粒,进行脂质体介导的TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达;应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应仪观察RNA干扰表皮生长因子受体后TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系Notch1的表达变化。结果免疫组织化学检测显示,在不同级别胶质瘤组织标本中Notch1的阳性表达率分别为Ⅳ级93.33%(14/15);Ⅲ级92.31%(12/13);Ⅱ级68.42%(13/19)。Ⅱ级阳性表达程度较Ⅲ、Ⅳ级弱,组间差异有高度统计学意义(H=6.944,P<0.01),提示高级别胶质瘤Notch1阳性表达率高于低级别。RNA干扰表皮生长因子受体后,Notch1在TJ905胶质母细胞瘤细胞系中的表达下降(F=578.728,P<0.01):TJ905组与TJ905+空载组相比,差异无统计学意义(P>0.05);TJ905+空载组与TJ905+516组相比,差异有统计学意义(q=6.359,P<0.05);TJ905+516组与TJ905+2400组比较,差异有统计学意义(q=4.501,P<0.05);TJ905组与TJ905+2400组相比差异亦有统计学意义(q=10.015,P<0.05)。责任基因相对表达量,TJ905组和TJ905+空载组均为2.48×10-5,TJ905+516组为6.64×10-6,TJ905+2400组为2.08×10-7。结论表皮生长因子受体与Notch1关系密切,对二者关系的进一步研究可为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。

SiRNA-EGFR对人乳腺癌细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的探讨SiRNA-EGFR对人乳腺癌细胞乳腺癌表皮生长因子受体表达的影响。方法应用RT-PCR测定RNA干扰人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453S、ZR-75和ZR-75-30后Hyase基因的mRNA的表达变化。结果 SiRNA-EGFR作用于表达不同水平透明质酸酶的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-453S、ZR-75-30和ZR-75后能明显抑制其乳腺癌表皮生长因子受体的mRNA表达水平(P<0.05)。结论 SiRNA-EGFR作用于人乳腺癌细胞后能特异性抑制EGFR的mRNA的表达水平。

RNA干扰技术对Hep-2细胞表皮生长因子受体表达的抑制作用及诱导凋亡

表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）是广泛表达于上皮源性肿瘤细胞膜上的一类跨膜糖蛋白,与肿瘤的增殖、转移和凋亡密切相关。本文通过构建EGFR基因的siRNA表达载体,观察抑制人Hep-2喉鳞状细胞癌（简称喉癌）细胞株EGFR的表达及诱导凋亡情况,为喉癌的基因治疗提供一定的基础理论依据。

RNA干扰表皮生长因子受体对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA载体介导抑制骨肉瘤细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达和对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法:构建pSilencer-EGFR短发夹状小干扰RNA(siRNA)真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到骨肉瘤细胞中,用Western印迹法、RT-PCR检测EGFR基因在骨肉瘤细胞中的表达;通过原位末端标记(TUNEL)法,DNA片段化检测观察其对骨肉瘤细胞凋亡的影响。结果:成功构建pSilencer-EGFR短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的骨肉瘤细胞中EGFR基因表达显著抑制(60%)。与对照组比较,pSilencer-EGFR转染组骨肉瘤细胞培养48h后,DNA片段化检测出"DNA ladder"和TUNEL法显示细胞典型凋亡特征。结论:EGFR小发夹RNA质粒载体可显著抑制骨肉瘤细胞中EGFR基因的表达,促进骨肉瘤细胞凋亡,EGFR基因具有抑制凋亡的作用。

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的:研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法:用pSIREN-hE转染细胞,其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector,含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链,大小为69 nt,含有2段19nt的寡核苷酸,用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链,评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株(HepG2)EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果:HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论:含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.

RT-PCR检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体和细胞角质蛋白-19mRNA的表达

目的 探讨逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR )方法检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体(EGFR)mRNA作为乳腺癌循环肿瘤细胞标志的可能性及意义。方法 以转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,分别对40例乳腺癌患者和30例健康人静脉血进行EGFRmRNA检测,同时与目前研究较多的循环上皮细胞标志:细胞角质蛋白CK-19的mRNA做比较。结果 在30例健康人外周静脉血中没有发现EGFRmR NA的表达( 0% ),但有8例CK-19阳性( 26. 7% )。而40例乳腺癌患者检测出13例EGFRmRNA阳性(32. 5% ),与正常人相比P<0. 01,两组间存在显著性差异;CK-19的mRNA阳性例数为14 (35. 0% ),与正常人相比P>0. 05,两组间无统计学差异。通过免疫组化检测到25例( 62. 5% )的肿瘤组织中EGFR阳性,所有外周血中EGFRmRNA阳性的病例,相应的原发肿瘤病灶中EGFR蛋白均为阳性,组织中EGFR蛋白高表达的患者外周血EGFRmRNA检出率也高(P<0. 01)。26例初治患者中5例EGFRmRNA阳性(19. 2% ),14例复治患者中8例EGFRmRNA阳性(57. 1% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。6例曾使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中1例EGFRmRNA阳性(16. 7% ), 8例未使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中7例EGFRmRNA阳性(87. 5% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。