甘蓝型油菜异三聚体G蛋白原生质体瞬时表达体系的建立

为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10.73×10~6/m L,活力可达96.4%。采用30%PEG转化原生质体时,目的蛋白表达量最高。Western Bolt的检测分析表明,异三聚体G蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ABA的应答反应,当ABA浓度分别为100,150,100,50 mmol/L时,Bn GA1、Bn GB1、Bn GG2和BnRGS1蛋白的表达量最高。

玉米转录因子ABP9瞬时表达体系的建立

[目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理。[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体,通过PEG介导的转化方法,建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统。利用该系统,通过反转录PCR和Western blot分别检测ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生质体中的转录和翻译;并通过转化ABP9∷GFP融合表达载体和GFP荧光检测,对ABP9进行亚细胞定位。[结果]玉米原生质体瞬时表达ABP9系统中,ABP9genomic∷FLAG融合基因能够正确转录出mRNA并翻译出蛋白质;利用该系统进行亚细胞定位结果显示ABP9定位于细胞核中。[结论]玉米原生质体瞬时表达ABP9体系的建立,为进一步探究玉米中ABP9的表达和调控提供了良好的实验系统。

絮凝选择载体的构建及β葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中的表达

从强絮凝酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)ABXL 1D菌株中用PCR方法扩增到絮凝基因 (Flocculationgene,FLO1) ,构建以絮凝基因作选择标记的酿酒酵母表达载体。用该载体表达Bacilluspolymyxa的 β 葡萄糖苷酶基因 ,转化子可直接从沉淀中筛选。摇瓶培养细胞得到的 β 葡萄糖苷酶比活力为 3.91u mg蛋白。在发酵葡萄糖和纤维二糖混合底物时 ,转化子的葡萄糖残存量明显低于受体菌。这将有利于利用纤维素发酵生产酒精。

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。

小鼠Znf230基因启动子与LacZ报告基因融合载体的构建及其在细胞中的表达

通过PCR扩增和限制性内切酶酶切克隆,获得1990bp的小鼠Znf230基因上游序列,经序列测定和P-Match软件分析,发现该段序列中可能含有2个CAAT-box、若干个性别决定因子Sry、Sox5、Sox30,以及数个参与胚胎期器官发生的基因HoxA3、Pax2、En1等的结合位点.为了研究此段序列的调控功能,构建了该段序列与LacZ基因融合的表达载体pMZnf230pro-LacZ.然后通过转染HeLa和NIH3T3细胞,发现pMZnf230pro-LacZ载体在两种细胞中都表达β-半乳糖苷酶,说明此段序列具有启动子功能.

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)多种胞壁降解酶基因表达载体的构建及转化水稻

为提高水稻的抗病性,利用哈茨木霉(Trichodermahazianum)P1菌株的3个胞壁降解酶基因ech42、nag70与gluc78构建了7个植物表达载体,每个基因受独立的Act1启动子调控.构建的7个载体不仅包含3个外源基因的所有组合(A,B,C,A+B,A+C,B+C,A+B+C),而且具有双元载体本身携带的HPT基因与Gus基因,为研究不同T-DNA长度、不同基因组合与不同基因排列方向对植物遗传转化效率以及外源基因在转基因植株中表达的影响提供了一套比较完整的材料.利用本实验室的农杆菌高效转化体系,将所有组合的7个载体分别转入粳稻品种石狩白毛(OryzasativaLssp.Japonicacv.Ishikari-shiroge)中,共获得再生植株1800余株.对部分再生植株进行了PCR检测,证明96%的植株至少携带有外源基因中的一个,80%以上的植株整合有完整的外源基因片断.

豌豆早期结瘤素基因PsSYM10的克隆及其表达载体的构建

采用Pri mStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsSYM10.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的同源基因在碱基和氨基酸序列上的相似性分别为98.6%和99.7%.将PsSYM10基因与结瘤相关基因PsENOD12、凝集素基因PsLectin串联组合,构建成了双元表达载体.

豆荚特异性启动子Pmsg的克隆及抗大豆食心虫植物表达载体的构建

植物基因工程载体构建时,一般采用组成型启动子,因涉及转基因食品安全性问题,在社会上引起争议。采用组织特异性启动子代替组成型启动子,既可调控下游基因的表达又能解决转基因食品安全性问题。采用同源克隆方法从栽培大豆绥农14中克隆了2 278 bp的豆荚特异性启动子Pmsg,与GenBank上的大豆msg基因启动子序列相似性为99%。构建了由启动子Pmsg调控经人工改造、具有抗大豆食心虫功能的基因(Cry1Iem)的表达载体pBMBt,以及由种子特异性启动子PGy2调控Cry1Iem基因的表达载体pBGBt,为抗大豆食心虫基因工程研究奠定了重要基础。

猪卵透明带ZP3α真核表达载体的构建及体外瞬时表达

目的 :构建猪卵透明带ZP3α真核表达载体 ,为探讨卵透明带DNA疫苗避孕疫苗奠定基础。方法 :采用PCR法获得了去除N端信号肽序列和C端跨膜区序列的猪卵透明带ZP3α的cDNA序列片段 ,以专门用于发展DNA疫苗的质粒pVAX1为载体构建了真核细胞表达质粒pVAX1-pZP3α。通过脂质体转染将之导入HeLa细胞进行体外瞬时表达 ,然后采用RT -PCR和间接免疫荧光技术 (IIF)检测pZP3α在mRNA水平的转录和蛋白质水平上的表达。结果 :真核细胞表达质粒pVAX1-pZP3α构建成功 ,用RT -PCR和IIF技术检测到了pZP3α在HeLa细胞中的转录与表达。结论 :真核表达载体pVAX1-pZP3α的成功构建和表达为研制开发有效的人用卵透明带DNA避孕疫苗奠定了基础。

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆血管内皮生长因子C(VascularEndothelialGrowthFactorC)功能片段的cDNA,构建人VEGF-C基因的真核表达载体,以便进一步研究VEGF-C在宫颈癌中表达的意义及在淋巴管生长及转移中的作用。方法:根据人VEGF-CcDNA序列,设计合成二对特异性引物,第一对5'端含有EcoRⅠ及第二对3'端含有XhoⅠ酶切位点。运用RT-PCR法克隆人MDA-MB231中的VEGF-CcDNA部分编码序列(CDS);经双酶切后将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5α中扩增,纯化。通过PCR和双酶切鉴定阳性重组子及进行基因序列的测定。结果:用RT-PCR克隆到VEGF-CcDNA部分CDS;PCR和双酶切鉴定阳性重组子,显示有人VEGF-CcDNA编码序列,基因序列测定显示重组质粒上插入的人VEGF-C序列正确。结论:从富含VEGF-C的人MDA-MB231细胞系中克隆得到的VEGF-C基因功能片段cDNA,成功构建了人真核表达载体pcDNA3.1(+)/VEGF-C。

人胸腺素α1真核表达重组体的构建及其转染人外周血淋巴细胞对后者免疫活性的影响

目的 :构建人胸腺素α1(Tα1)真核表达重组体 p BK- Tα1,并研究其转染人外周血淋巴细胞 (PBL)对后者免疫活性的影响。方法 :将已构建的 Tα1克隆重组体 p UC18- Tα1经 Eco R I、Hind 酶切 ,获得 Tα1片段 ,再将其克隆入真核细胞表达载体 p BK- CMV得到 p BK- Tα1重组体 ,p BK- Tα1以脂质体包裹的方法转染 PBL细胞 ,作 RT- PCR在 m RNA水平检测 p BK- Tα1在 PBL细胞中的表达。用 E玫瑰花环试验检测转染 p BK- Tα1后的 PBL细胞中T淋巴细胞表面 E受体的表达情况 ,并以酶联免疫吸附试验检测转染 p BK- Tα1后的 PBL细胞培养上清中的 IFN- γ和 IL- 2值。结果 :构建成功 Tα1真核细胞表达重组体 p BK- Tα1;在 m RNA水平证实 ,p BK- Tα1可在 PBL细胞中得以转录 ;初步证实 p BK- Tα1转染入 PBL细胞可促进 IFN- γ、IL- 2的表达和 T淋巴细胞表面 E受体的产生。结论 :p BK- Tα1在 PBL细胞内的表达可能会增强

利用杨树原生质体瞬时表达系统筛选杨生褐盘二孢菌效应因子蛋白

效应因子蛋白在病原真菌侵染宿主植物过程中发挥着重要作用,效应因子的筛选和鉴定是目前研究的难点。笔者以杨生褐盘二孢菌全基因组测序结果为基础,根据真菌效应因子蛋白结构特征,预测出106个候选效应因子,并成功克隆其中25个。利用杨树原生质体瞬时表达系统对这25个候选效应因子蛋白进行细胞内功能筛选,鉴定出4个效应因子蛋白可以抑制杨树转录因子WRKY29启动子的活性,表明这4个效应因子蛋白在干扰植物免疫系统的信号传导途径中发挥重要作用。

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。

利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载体系统在柞蚕蛹中表达人生长激素

为探究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）表达载体一柞蚕蛹表达系统用于表达哺乳动物活性蛋白的可行性，利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH）。构建插入hgh基因的转移表达载体pApM748BE／hgh，将该转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh’基因组DNA共转染樗蚕（Philosamiacynthiam）培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh。采用Westernblotting和ELISA方法，检测到柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV—△ph／-△ph／Aefp／hgh／hgh’后第7天体液中就有hGH明显表达；感染后第13～14天蛹体液中的hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量可达251．18肛g／mL；感染后第15～20天仍可以检测到hGH的表达，但表达产物出现降解现象。用活化的人红白血病细胞K562检测利用ApNPV表达载体系统在柞蚕蛹表达的重组hGH的体外活性，结果显示其对K562细胞的增殖具有明显的促进作用。

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。

填精通络方及其拆方对糖尿病性勃起功能障碍大鼠的性激素及阴茎海绵体eNOS酶表达的影响

目的:通过观察填精通络方及其拆方对糖尿病性勃起功能障碍大鼠性激素及阴茎海绵体eNOS酶表达的影响,探讨填精通络方在治疗糖尿病性勃起功能障碍的作用机制。方法:将60只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、对照组、填精组、通络组及填精通络组6组,每组10只。除正常组外,其余组以腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,任意时间血糖>16.67 mmol·L^-1为糖尿病成模标准,然后用阿朴吗啡阴茎勃起实验筛选糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型。成模后,对照组予以0.2 mg·kg^-1他达拉非灌胃,每周两次;填精通络组予以填精通络方以9.3 g·kg^-1·d^-1灌胃,填精组予以拆方Ⅰ号以7.2 g·kg^-1·d^-1灌胃,通络组予以拆方Ⅱ号以2.1 g·kg^-1·d^-1灌胃,正常组与模型组分别灌服等体积蒸馏水,连续30天。取腹主动脉血清,用酶联免疫分析法测定各组大鼠的性激素水平的差异;便携式血糖仪检测各组大鼠的血糖水平;免疫荧光检测离体阴茎组织eNOS酶含量。结果:与模型组比较,填精组、通络组及填精通络组的血糖明显降低(P <0.01),阴茎海绵体eNOS酶的表达改善,血清睾酮(T)含量明显上升(P <0.05),而卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)含量变化不明显(P> 0.05);与对照组比较,填精通络组的血糖明显降低(P <0.01),阴茎海绵体eNOS酶的表达改善,血清T含量明显上升(P <0.05),而血清FSH、LH含量变化不明显(P> 0.05);与通络组比较,填精组和填精通络组的血糖明显降低(P <0.05),但填精组阴茎海绵体eNOS酶的表达改善不如通络组,而填精通络组阴茎海绵体eNOS酶的表达改善优于通络组。结论:填精通络方能明显降低大鼠血糖水平,改善大鼠性激素水平和阴茎海绵体eNOS酶表达,从而改善大鼠的勃起功能障碍。

罗非鱼微囊藻毒素去毒相关基因克隆与活体表达研究

可溶性谷胱甘肽S-转移酶(Soluble glutathione S-transferase,sGST)催化微囊藻毒素(Microcystins,MCs)与还原型谷胱甘肽(GSH)的加合去毒代谢过程,谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)为sGST的去毒反应提供GSH,解偶联蛋白2(Uncoupling protein 2,UCP2)则可抑制微囊藻毒素诱发活性氧导致的肝细胞凋亡。本研究从罗非鱼肝脏通过简并引物克隆sGST、GPX与UCP2基因cDNA核心序列,并应用5’RACE和3’RACE技术分别扩增罗非鱼肝脏sGST基因cDNA序列5’末端和3’末端序列而获得其cDNA全序列。罗非鱼肝脏sGST基因cDNA全序列长861 bp,其中5’非翻译区(5-’UTR)为25 bp,3’非翻译区(3-’UTR)为167 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码222个氨基酸,包含脊椎动物完整sGST的2个功能域:N-末端功能域(GSH结合位点)和C-末端功能域(底物结合位点)。罗非鱼sGST与真鲷、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、斑马鱼同源性较高,达到64.3%—78.5%,而与人、大鼠、小鼠、牛、猪、鸡差异较大,氨基酸同源性为48.2%—55.9%。罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因cDNA核心序列长280 bp、776 bp,分别编码92、258个氨基酸。罗非鱼GPX与条石鲷、虹鳟、斑马鱼、人、大鼠、小鼠、牛、猪GPX同源性均较高,达到69.6%—85.9%。罗非鱼UCP2与真鲷、斑马鱼、鲤鱼、欧洲白鲑(Leuciscus cephalus)、草鱼、人、大鼠、小鼠UCP2同源性更高,达到71.8%—93.8%。通过对罗非鱼(5—8 g)活体腹腔注射亚致死量MC-LR(50μg/kg bwt),发现微囊藻毒素对罗非鱼肝脏sGST基因表达有显著的诱导作用(p<0.05),注射微囊藻毒素24h后sGST基因mRNA表达水平上调80%。注射微囊藻毒素24h后,虽然罗非鱼肝脏GPX与UCP2基因mRNA表达水平亦出现明显的升高趋势,但两者均未出现显著性的变化(p>0.05)。本研究从基因表达调控的角度证实,罗非鱼肝脏sGST在微囊藻毒素去毒过程中可能发挥关键作用,同时也说明罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因可能在微囊藻去毒过程中发挥协同作用。

猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化

目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定。结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG。结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础。

大鼠全长OBRbcDNA克隆及真核表达重组体的构建

目的 克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cD NA(OBRbcDNA)及构建其真核表达重组体 ,为进一步研究该基因打下基础。方法 应用RT PCR方法分段扩增全长OBRbcDNA ,再将它们连接起来 ,并获得载有全长OBRbcDNA的阳性克隆质粒。将上述质粒中全长OBRbcDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中 ,筛选出阳性克隆。通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定。结果 重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致。结论 成功地克隆了SD大鼠全长OBRbcDNA 。

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。