汉滩病毒核酸疫苗滴鼻免疫小鼠表达动力学研究

目的 构建汉滩病毒DNA疫苗 ,考查小鼠鼻内接种DNA疫苗后的基因组织定位及表达动力学 ,为进一步研究汉滩病毒DNA疫苗粘膜免疫的疗效作前期准备。方法 采用PCR法从PJSA1175 S质粒扩增汉滩病毒的S基因片段后装入PcDNA3 1B(- )载体 ,并以此候选DNA疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠 ,在不同时间、不同部位取其组织抽提基因组DNA和组织总RNA ,用PCR及RT PCR检测质粒的分布和表达动力学。结果 构建了汉滩病毒DNA疫苗PcDNA3 1B S1 3 。免疫接种该疫苗第 1天后在小鼠鼻咽、肺、肾、肝、脾、小肠等组织中均有质粒分布 ;第 1周内上述组织中均可检测到特异mRNA ,第 2周起小肠、肝及肾中特异mRNA消失。结论 成功构建了PcD NA3 1B S1 3 DNA疫苗 ,构建的疫苗滴鼻免疫后在小鼠体内得到广泛的分布及表达。

发育阶段M-CAT结合因子的组织分布及表达动力学

采用胶阻滞和ＤＮＡ蛋白质印迹技术分析了鸡胚和雏鸡发育不同阶段骨骼肌、心肌、胗、肝和脑组织核抽提物中ＭＣＡＴ结合因子（ＭＣＢＦ）与含ＣＡＴＴＣＣＴ、ＣＡＴＴＧＣＴ核心序列的寡核苷酸的相互作用．胶阻滞实验结果表明，被检的五种组织均有ＭＣＢＦ结合活性存在，但结合模样不完全相同；两寡核苷酸探针与同一骨骼肌核抽提物结合模样也不相同．采用两寡核苷酸为探针对五种组织核抽提物进行ＤＮＡ蛋白质印迹分析均检出一分子质量约３０ｋｕ核因子，提示３０ｋｕ核因子是存在于五种组织中的普遍因子，该因子可直接或以同二／多聚体结合ＣＡＴＴＣＣＴ、ＣＡＴＴＧＣＴ序列，属ＭＣＢＦ结合活性的基本组成成分．除普遍因子外，胶阻滞分析结果不排除各组织存在的特异因子通过蛋白质蛋白质相互作用、与３０ｋｕ因子形成杂聚体结合ＤＮＡ的可能性．骨骼肌组织３０ｋｕ因子在胚胎发育１８天前表达，出生后消失．

大鼠脑、心、肝、脾、肾Hsp60基因表达动力学研究

研究了大鼠脑、心、肝、脾和肾中Ｈｓｐ６０基因表达的积累动力学和恢复动力学规律，同时发现了大鼠等恒温动物在高温应激期间的体温变化具有四个时相（快速升高期、缓慢升高期、缓慢降低期和回升期）的规律。在积累动力学研究中，发现大鼠不同脏器表达Ｈｓｐ６０具有以下规律：脑组织中Ｈｓｐ６０呈现出１５ｍｉｎ内快速升高而后迅速降低并稳定在很低的水平；心和肾组织中，Ｈｓｐ６０呈现出７５ｍｉｎ内随受热时间延长而升高的趋势，其后缓慢下降并均高于对照组，且在脾组织中，Ｈｓｐ６０也呈现出６０ｍｉｎ内缓慢升高而后缓慢降低的变化；肝脏组织中，Ｈｓｐ６０呈现出积累量在应激组均低于对照组且表现出在热应激４５ｍｉｎ内升高而后缓慢降低的趋势。在恢复动力学研究中发现：（１）在脑组织中，Ｈｓｐ６０含量在１０ｈ的恢复期间呈递增趋势（１０ｈ恢复达最高值，为对照组的４倍左右），尔后略为下降；（２）心、肝和脾组织中，Ｈｓｐ６０变化均呈现４ｈ内逐渐减少而后缓慢升高的趋势，分别在１０ｈ、８ｈ、１０ｈ达最大值，在肾组织中Ｈｓｐ６０含量变化也有类似现象（６ｈ内缓慢降低而后快速升高并在恢复１０ｈ左右达最大值），其主要不同点是在恢复前８ｈ内变化幅度较小；

鸡骨骼肌发育过程生肌素的表达

ＭｙｏＤ家族生肌因子ＭｙｏＤ、生肌素（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ｍｙｆ－５和ｍｙｆ－６／ｈｅｒｃｕｌｉｎ对脊椎动物肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟具有重要意义，其中生肌素的作用尤为突出，是肌细胞终末分化的关键因素。采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术检测鸡胚骨骼肌发育过程中生肌素在转录水平的表达动力学，发现在胚胎发育第９ｄ已有鸡肢体骨骼肌生肌素ｍＲＮＡ表达，第１３ｄ达到高峰，第１５ｄ开始下降，第１８ｄ至出生后两周几无可检测的ｍＲＮＡ；而生肌素蛋白则在胚胎发育第１３ｄ方可被检测到，第１５～１８ｄ达到高峰，至出生后两周仍维持在一定水平，表明生肌素的表达存在翻译和翻译后水平的调控。利用鸡生肌素基因上游－２２３／＋４０调控片段为探针对发育不同时期的鸡肌肉组织细胞核抽提物进行Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析。发现一种约３５ｋＤ的核内蛋白与探针有较强结合，结合活性第９ｄ时出现，至第１８ｄ达到峰值，出生后两周时降至难检测水平；另外有一种约１１ｋＤ的核内蛋白的ＤＮＡ结合活性恰好在转录活性下降的第１５～１８ｄ发生，按此情况两种核因子可能对生肌素的转录激活分别起正负调控作用。

神经胶质细胞生长因子对快速起搏所致猴心衰的保护作用及机制研究

目的研究重组人神经胶质细胞生长因子(NRG)对快速起博所致猴心衰心肌收缩力的影响及给予重组人NRG后心肌细胞内葡萄糖转运蛋白1(Glut1)mRNA表达水平的变化。方法成年雄性恒河猴24只,随机分为假手术组、心力衰竭组及NRG治疗组,每组8只。治疗组240次/min起搏7d后,起搏状态下连续10d,每天1次静脉注射重组人NRG3μg/kg,心力衰竭组给予同体积生理盐水。连续给药10d结束后,测定左心室的最大压力上升速度(LVdp/dtmax)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室收缩末期压(LVSP)等血流动力学指标。提取左室心肌组织mRNA,采用RT-PCR的方法分析PKB、Glut1mRNA的表达水平。Western Blotting测定心室肌磷酸化PKB蛋白含量。结果心力衰竭组LVdp/dtmax、LVSP低于假手术组(P<0.05),LVEDP高于假手术组(P<0.05);NRG治疗组LVdp/dtmax高于心力衰竭组(P<0.05),LVSP有上升的趋势(上升了11%),LVEDP有下降的趋势(下降了39%)。心力衰竭组PKB、Glut1mRNA表达水平均低于假手术组(P<0.05);治疗组PKB、Glut1mR-NA表达水平高于心力衰竭组(P<0.05)。治疗组磷酸化PKB蛋白水平比心力衰竭组上升了177%(P<0.05)。结论重组人NRG可能通过向上调节PKB、Glut1mRNA表达水平,改善缺血心肌能量供应这一机制来增强心肌收缩力,从而达到治疗心衰的目的。