旋毛虫副肌球蛋白在BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

利用Baculo Direct昆虫杆状病毒表达系统表达重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Trichinella spiralis paramyosin,r Ts Pmy),以获得生物学活性较好的重组蛋白。通过PCR和DNA重组方法构建含Ts Pmy基因的Gateway入门载体重组质粒p DONR221(p DONR221/Ts Pmy),经测序鉴定后,扩增重组质粒;利用重组质粒p DONR221/Ts Pmy和Baculo Direct线性杆状病毒进行Gateway DNA重组反应,构建重组病毒,用其直接感染昆虫细胞Sf9使得重组病毒具有感染活力;连续感染Sf9以扩增病毒,利用滴度较高的病毒感染Sf9进行r Ts Pmy表达;SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定表达的重组蛋白r Ts Pmy。结果显示,重组质粒经测序鉴定显示序列正确;SDS-PAGE及Western blotting显示r Ts Pmy分子量大小约110 k Da,未见不完全表达;可溶性分析显示r Ts Pmy部分可溶,大部分为不可溶沉淀;Western blotting结果显示r Ts Pmy可被旋毛虫感染的小鼠和猪抗血清识别,具有抗原特异性。本研究首次利用Baculo Direct昆虫杆状病毒表达系统成功表达了r Ts Pmy,获得翻译后修饰更加完善、纯化效果更好的重组蛋白,对于进一步研究Ts Pmy的功能,为制备有效的旋毛虫病疫苗候选抗原分子提供了生物学基础。

多房棘球绦虫钙网蛋白的原核表达及初步鉴定

目的原核表达多房棘球绦虫钙网蛋白EmCRT,并对其免疫学功能进行初步鉴定。方法以多房棘球绦虫囊cDNA为模板,PCR扩增目的基因,克隆至pGEX-4T-2载体,构建重组质粒pGEX-4T-2-EmCRT;PCR、酶切鉴定及测序正确后,转化至表达菌BL21(DE3),并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;运用10%SDS-PAGE电泳以及Western blot分析鉴定表达的重组蛋白rEmCRT。结果成功构建了重组质粒pGEX-4T-2-EmCRT,转化表达菌BL21后,经IPTG诱导表达及纯化,获得了纯度较高的可溶性重组蛋白rEmCRT,相对分子质量约为72 ku(含表达载体序列);通过Stains all染色,表明rEmCRT具有Ca^(2+)结合能力;免疫学特性鉴定表明rEmCRT具有较好的抗原特异性。结论成功表达多房棘球绦虫钙网蛋白EmCRT,具有免疫反应性,可为包虫病诊断及其疫苗研发提供理论基础。