利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究

为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。

通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析。方法:限制性内切酶EcoRV酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1:640。结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析。

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。

口蹄疫病毒O/China/99株多基因植物组成型表达载体的构建及序列分析

目的构建包含FMDV结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B的基因片段P12X3C的植物组成型表达载体,为FMDV可饲疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增法,从pGEM/P12A质粒和pGEM/3C质粒中扩增P12A及部分2B基因(P12X)、3C基因,将获得的P12X与3C片段经BamHI/SpeI和SpeI/SalI双酶切后,与经BamHI/SalI双酶切后的pUC18质粒大片段连接,得到重组质粒pUC18/P12X3C,pUC18/P12X3C质粒经BamHI/SalI双酶切后的大片段与经同样双酶切的植物表达载体pBin438连接,转化子经酶切、PCR及测序鉴定后,获得包含FMDV O/China/99株P12X3C片段的植物组成型表达载体pBin438/P12X3C,最后通过三亲交配法,将表达载体pBin438/P12X3C导入农杆菌。结论成功构建FMDV多基因的植物组成型表达载体。

hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL .

高效表达型T克隆载体的构建及其特性

目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1∶640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。

利用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达载体系统在柞蚕蛹中表达人生长激素

为探究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）表达载体一柞蚕蛹表达系统用于表达哺乳动物活性蛋白的可行性，利用该表达系统表达医用蛋白人生长激素（hGH）。构建插入hgh基因的转移表达载体pApM748BE／hgh，将该转移表达载体质粒DNA与病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh’基因组DNA共转染樗蚕（Philosamiacynthiam）培养细胞Pc一01，用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-△ph／Aefp／hgh。采用Westernblotting和ELISA方法，检测到柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV—△ph／-△ph／Aefp／hgh／hgh’后第7天体液中就有hGH明显表达；感染后第13～14天蛹体液中的hGH含量保持较高水平，重组hGH的最高表达量可达251．18肛g／mL；感染后第15～20天仍可以检测到hGH的表达，但表达产物出现降解现象。用活化的人红白血病细胞K562检测利用ApNPV表达载体系统在柞蚕蛹表达的重组hGH的体外活性，结果显示其对K562细胞的增殖具有明显的促进作用。

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

人血管抑素基因分泌型融合载体的构建与表达

【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载体,回收纯化后做定向克隆连接,转化E.coliDH5α;XbaⅠ及EcoRⅠ双酶切电泳与测序鉴定pEZZ18-As;诱导培养重组菌,表达目的蛋白。【结果】酶切pEZZ18-As,电泳分析插入片段长度为1111bp,与预期结果一致,对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确;SDS-PAGE分析诱导培养重组菌,新出现的蛋白大小约61kD,与预期相符。【结论】成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白,该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。

植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建

乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性,本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA基因启动子,以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子,采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA基因启动子连接到gusA基因上游,获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中,Western Blot定性测定的gusA表达情况,同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性,为利用该启动子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。

利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究

利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp)插入pAO815之HindⅢ EcoRⅠ之间,构建成含α factor信号肽基因的分泌型表达载体pAO815α A.

细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因设计及其毕赤酵母表达载体构建

设计及合成细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因,克隆到组成型分泌表达质粒pGAPZαA中构建重组质粒pGAPZα-Bacteriocin E(H),经PCR、测序验证正确后,电转化整合到毕赤酵母基因组,基因组PCR、测序验证结果表明成功构建了细菌素组成型重组表达载体,为在毕赤酵母中表达奠定了基础。

口蹄疫病毒O/China/99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。