小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签(ESTs)分析(英文)

小麦条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)是全世界范围内小麦生产上的重要病原真菌,但是对小麦条锈菌的基因组和基因功能却了解甚少。为了促进小麦条锈菌基因组学的发展和大规模基因发现,我们以噬菌体λTrip1Ex2为载体,采用SMART技术构建了小麦条锈菌萌发夏孢子的cDNA文库。原始文库的滴度为1.1×106pfu/mL,平均插入片段长度为750 bp。从文库中随机挑取279个cDNA克隆测序,分析发现这些ESTs的平均GC含量为45.08%。通过聚类分析,279个ESTs拼接成31个contigs和80 singletons。BLASTx分析表明,47%的ESTs与GenBank中报道的功能已知或未知蛋白具有相似性。tBLASTx分析表明12个uniseqs与EST数据库中的序列具有相似性,其中9个是来自担子菌的cDNA文库。几个EST与已知的真菌致病相关基因具有高度相似性。RT-PCR分析了几个基因在小麦条锈菌侵染过程中的表达水平。这些结果为小麦条锈菌夏孢子萌发以及侵染寄主过程中的基因表达研究奠定了很好的分子生物学基础。

一种基于表达序列标签(EST)的新型目标分子标记技术——保守区域扩增多态性(CoRAP)

CoRAP分子标记技术是一种基于表达序列标签的目标分子标记新技术,具有操作简单、重复性高和特异性强等优点。该分子标记的原理是:根据表达序列标签来设计1个固定引物,根据大多数内含子内部的一段保守序列设计另1个随机引物,在退火温度为52℃的常规3步法PCR程序下,扩增产生偏向表达序列标签附近区域的显性或共显性标记。该分子标记可以作为SRAP、TRAP标记有效补充的目标分子标记新技术,在生物多样性分析、遗传图谱构建、重要性状基因标记、QTL定位及分子标记辅助育种等方面均有较大的应用潜力。

苎麻茎皮表达序列标签(ESTs)分析

以生长中期的苎麻[Boehmeria nivea(L.) Gaud]茎皮为材料,构建库容量为2.2×105pfu/mL的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行测序和生物信息学初步分析,得到275条有效序列。通过与NCBI等数据库比对分析,获得已知功能基因或具推测功能基因的EST91条,已知EST37条,新的EST147条,具已知或推测功能的ESTs大致分为9类,其中与蛋白质合成有关的ESTs所占比例最大。cDNA文库的构建和ESTs分析为苎麻功能基因组学研究提供了一条方便快捷的途径。

表达序列标签(EST)的研究现状

表达序列标签是由大规模随机挑取的cDN克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。1个表达序列标签(EST)代表生物某一时期的某种组织或细胞的1个表达基因。其在基因组研究中的应用已具有良好的前景。本文综述了EST的研究现状、应用及发展。

西瓜与枯萎病菌非亲和互作的表达序列标签分析

目的从整体水平上阐明西瓜与枯萎病菌非亲和互作基因表达的特征。方法用SSH方法构建枯萎病菌接种处理后不同时间点的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。结果在测定4431条cDNA序列中,序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。结论在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息,这些基因的发现为在分子水平上研究西瓜与枯萎病菌的互作机制以及相关重要基因的克隆与功能分析奠定基础。

条锈菌诱导的小麦抑制差减杂交文库构建及其表达序列标签研究

利用抑制差减杂交技术构建了条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的小麦叶片cDNA文库。文库质量检测表明:差减杂交效率较高,质量较好。用DNAStar5.0对172条高质量的ESTs进行聚类,共获得120个contigs。对功能已知的contigs分类,能量和初级代谢类占32.5%,其中与光合作用相关的基因出现频率最高;参与膜及转运、抗病与防御的基因分别位于第二、三位;次生代谢、蛋白质合成加工和细胞结构建成的基因较少。通过分析抗病相关基因,初步推测HR和SAR可能为小麦抗条锈病过程中的2种抗性形式。最后利用RT-PCR对4条感兴趣基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。

利用GenBank中大量葡萄EST序列分离有效基因的电子表达分析平台

【目的】充分利用GenBank上的大量葡萄EST序列,建立本地化基因电子表达分析平台,实现基因表达模式的大规模快速分析。【方法】利用生物信息学方法对GenBank上的362 193条葡萄EST序列进行本地化及后续处理,建立电子分析平台,并通过RT-PCR技术对其电子分析准确性进行验证。【结果】建立了包含叶、花等11个组织类别和GA3等5个胁迫类型的基因电子表达分析平台。通过VvAG、VvCHS、VvF3H、VvLDOX等4个葡萄基因的RT-PCR和电子表达分析结果比较发现,平台预测效率较高,在预测EST来源数较多的果实、花序、花组织的表达效果较好,而对叶等EST来源较少的组织的预测效果需结合试验判断。随着dbEST库中源于葡萄各组织EST序列数量的大量增加,平台的预测效果将更加符合基因表达的实际情况。【结论】葡萄基因电子表达分析平台预测效率较高,为葡萄基因大规模快速表达分析以及重要相关信息的挖掘提供了很好的分析工具。

溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾消减文库的构建及其表达序列标签分析

利用抑制消减杂交技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)诱导的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞cDNA文库。用DNAMAN5.2.2软件对560条高质量的ESTs进行聚类,共获得239个Unigenes。与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中66.9%为已知功能基因,33.1%为未知功能基因,GO分类将其分为7类,包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36%,免疫相关基因占15%,其他基因占8%,信号转导类占3%,抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2%,核蛋白类占1%。实验结果表明凡纳滨对虾在溶藻弧菌诱导下可产生一系列特异基因的表达,通过对文库的分析显示,基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。

曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库的构建和表达序列标签分析

以曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)肌肉组织为研究材料,利用Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒构建了曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库.对文库质量的分析结果表明:cDNA文库的库容量约为1.2×106克隆(cfu/dm3),重组率达96%,插入片段平均长度大于1 000 bp.挑取568个阳性克隆进行5’末端测序,其中475条ESTs长度大于100 bp,初步拼接后得到200个单基因簇,包括41个重叠群和159个单拷贝EST,冗余度为57.89%.经检索,53条ESTs(占比为26.5%)在BLASTx上无明显的同源性(E值≥1.00×10-10),为新基因.147条ESTs(占比为73.5%)与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的23.0%.细胞信号传导、细胞骨架和蛋白质代谢的次之,比例分别为17.5%、12.5%、9.5%,其中包括热激蛋白70、转铁蛋白等.这些EST数据有助于进一步筛选和克隆曼氏无针乌贼和其他头足动物的肌肉特异性表达基因.

哈茨木霉cDNA文库构建及表达序列标签分析

为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序分析,其中67条EST为已知基因,58条为已知EST,其余的180条为新EST.在已知基因中,有9条ESTs与生物防治相关.从对文库的初步检验结果看,文库具有良好的质量,符合大规模测序的标准.通过ESTs研究是获得功能基因的有效手段.

表达序列标签在寄生虫功能基因组学研究中的应用

随着后基因组时代的到来,基因组学已从结构基因组学向功能基因组学领域拓展。表达序列标签(expressed sequence tags,EST)是一种快捷、高效地揭示基因组功能信息的方法。本文就EST在寄生虫功能基因组学研究中的应用作一综述。

低渗诱导凡纳滨对虾肝胰腺消减文库的构建及其表达序列标签分析

初始体重（0．27±0．01）g的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）分别于盐度2和30中饲养56d，采用抑制性消减杂交技术构建低渗胁迫诱导的凡纳滨对虾肝胰脏差异表达基因消减cDNA文库。消减杂交效率分析显示，正反向消减文库差异表达的基因各富集大约25和2^5-10倍。从正反向两个文库中随机挑选200个阳性克隆进行测序（正向文库80个，反向文库120个），共获得179条序列长度大于100bp的ESTs序列，经CAP3在线拼接程序得到73条Unigenes（19条contigs和54条singlets）。生物学信息分析表明，这些Unigenes所代表的相应基因的功能包括免疫相关蛋白、代谢相关蛋白、核蛋白、细胞凋亡和转移蛋白。这些基因信息表明，凡纳滨对虾在低盐胁迫诱导所导致的生理变化非常复杂，构建的差异表达cDNA文库可较好地反映低盐胁迫对凡纳滨对虾影响的基因信息。

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

随着生物信息学的发展,表达序列标签(EST)在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。简要介绍了EST分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、DNA芯片制备等方面的应用概况。综述了甲壳动物EST的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。

小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签(EST)进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106pfu·ml-1,扩增文库滴度2×109pfu·ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。

基于EST序列的鲤鱼生长相关SNP发掘

以本研究室454测序获得的EST序列和公共数据库中下载的共255,768条鲤鱼EST序列为源序列,鉴定出与生长相关的EST序列5,375条;采用QualitySNP软件,在31个EST重叠群中检测到69个可信度高的与生长相关的SNP,SNP发生频率为0.29/100个碱基。其中包括转换型35个,颠换型30个和缺失型4个。非同义SNP为46个,同义SNP为23个,二者比值为2.0。对所鉴定的SNP进行注释表明,这些包含SNP的生长相关基因归为20类,数量最多的为血纤维蛋白溶酶原基因4个、其次是载脂蛋白基因和磷酸甘油醛脱氢酶基因分别为3个。本研究所开发的SNP将促进鲤鱼生长性状的分子基础研究,为鲤鱼分子育种服务。

基于胡鲇科和鲇科ESTs序列初步筛选兰州鲇EST-SSR分子标记

利用SSRHunter软件对现已公布的鲇形目（Siluriformes）中胡鲇科（Clariidae）和鲇科（Siluridea）共2002条EST（Expressed Sequence Tag）序列筛选兰州鲇（Silurus lanzhouensis）微卫星标记,并分析其序列丰度和分布特征。结果共发现209个微卫星序列,占整个ESTs数据库的10.44%;其中三碱基重复序列数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的35.62%;二、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的28.31%、25.57%、7.76%、2.74%。根据侧翼序列,设计125对引物,随机选取58对进行扩增鉴定及多态性筛选。结果显示29对引物能稳定扩增,16对引物具有多态性,每个位点等位基因数2-7个（平均3.75）,观测杂合度（Ho）0.133 2-0.732 2（平均0.405 1）,期望杂合度（He）0.198 2-0.848 3（平均0.560 2）,多态信息含量（PIC）0.124 1-0.794 5（平均0.506 5）。研究表明,借用已有鲇形目鱼类ESTs数据库筛选到的兰州鲇微卫星标记质量较好,可为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助育种奠定基础。

甘蔗茎全长cDNA文库构建及EST序列分析

在利用改进的Oligo-capping法构建1个高质量的甘蔗茎全长cDNA文库基础上,对该文库进行大规模测序,获得了283条5′端有效EST序列,平均长度为459 bp,经聚类和拼接获得204个假定独立转录本(TUTs),冗余序列所占比例27.9%。NCBI同源比对分析结果表明,其中132条EST拼接的103个TUTs与已知功能基因具有较高的同源性,结合拟南芥功能基因分类标准对这些TUTs进行分类,可分为12类,以参与蛋白质合成的基因最多,其次为细胞结构、蛋白质降解和贮藏、转录等类型的基因。

西施舌浮游幼虫cDNA文库构建及EST序列初步分析

为了研究西施舌浮游幼虫阶段的基因表达规律,构建了7日龄浮游幼虫的cDNA文库,对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.3×10~5,重组率达95%,平均插入片段长度1.0 kb左右.挑取cDNA克隆进行5′端测序,总共进行了304个成功反应,其中294条ESTs长度为100~699 bp,平均长度为492 bp.初步拼接得到158个单基因簇(Unigene),其中包括19个重叠群(Contigs),139个单拷贝ESTs(Singletons).与GenBank非冗余蛋白库进行Blastx比对,发现71.4%ESTs在GenBank中有同源序列(blast score≥50 bits),无明显相似性EST序列占28.6%,提示此文库有许多未知的基因.丰度最高的是组蛋白cDNA(包括组蛋白H1和组蛋白H2A),占总EST序列的39.5%.在116个ESTs中获得组蛋白H1和H2A基因的2个开放阅读框,分别为561和375个碱基,编码186,124个氨基酸残基的肽段.

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群(Contigs),经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框(ORF),其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列(ESTcontig110和ESTcontig133)进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段(ORF)与实际扩增片段(ORF)基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列(猪的60S核糖体蛋白L18a亚基)进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。

基于中国明对虾不同组织EST数据的基因表达差异分析

对前期获得的中国明对虾头胸部、血液、眼柄、卵巢4种组织的EST测序数据进行了生物信息学挖掘和分析。4种组织的原始EST序列分别为10 446条、2 690条、1 067条和1 282条,通过聚类拼接得到unigene 3 454条、1 053条、406条和544条,对其进行了NR、GO、KEGG等数据库的功能注释,并在此基础上进行了组织差异分析。通过同源比对的方法找出了各组织特异的转录本,并根据注释信息将其进行了GO功能分类。结果显示,血液组在细胞杀伤、迁移和节律等功能分类上特异性富集;眼柄组在色素生成、信号传递和生物学调控等功能分类上特异性富集;卵巢组在营养贮存运输、繁殖和定位等功能分类上特异性富集。拼接时聚类到一起的EST数目在一定程度上可以代表基因的表达量,据此对各组织的高表达基因进行了分析。结果显示,peritrophin、elongation factor 1-alpha、thrombospondin和arginine kinase 4个基因在组织中分布较为广泛且表达量高,提示其可能参与对虾多种重要的生物学过程。而在血液组中注释到的高表达基因还包括penaeidin、cytochrome c oxidase和14-3-3 like protein基因,在眼柄组中注释到的高表达基因还包括arrestin和rhodopsin基因。此外,为了解各组织共有基因的差异表达情况,对peritrophin和peroxiredoxin进行了分析,发现了peritrophin基因的多形式和高表达现象。