勘误:EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2009年第25卷第11期第1013-1015页的“EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定”论文中,图2A及图3用错了荧光显微镜和流式细胞术的图像。

DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其生物学特性鉴定

目的为研究肺癌发生机制中DNA氧化损伤修复基因HOGG1的可能作用,利用携带有HOGG1特异性锤头状核酶基因的载体与肺腺癌A549细胞株,建立HOGG1低表达细胞株并观察其生物学效应。方法HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体[pcDNA3.1(+)RZ]经脂质体介导转染A549细胞;G418筛选;Neo基因的RTPCR法鉴定阳性克隆细胞;RTPCR半定量检测核酶对HOGG1基因的抑制效应。同时比较转染细胞与正常A549细胞的生长情况、细胞周期、软琼脂克隆形成率以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果转染后G418成功筛选出了阳性转化克隆,经传代形成稳定细胞株。核酶可持续抑制A549细胞HOGG1基因的表达,RTPCR结果显示转染细胞HOGG1mRNA的表达比正常A549细胞低61.5%(P<0.05);转染后,细胞株形态无明显改变;其群体细胞倍增时间为2.05天,稍短于正常A549细胞(2.17d);细胞周期各时相及细胞凋亡率以及细胞增殖指数没有明显改变(P>0.05);软琼脂克隆形成抑制率接近50%(P<0.05);SOD活力比正常A549细胞显著增加(P<0.05)。结论成功建立HOGG1低表达细胞株,所观察的生物学效应多数指标与正常A549细胞无显著差异。

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeftyA真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Lefty基因可能通过拮抗转化生长因子β1信号通路发挥抗肾纤维化作用。目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeftyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系。设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成。材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;LeftyA克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司。方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得LeftyA编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建LeftyA真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建LeftyA稳定表达细胞系。主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果。重组质粒的酶切鉴定结果。重组质粒基因测序结果。LeftyA稳定表达细胞系的筛选及其细胞内LeftyAmRNA表达。结果:pCMV-SPORT6经针对人LeftyA基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在1.0kb条带处出现稍大于1.0kb的特异性扩增条带,与预期1.1kb目的片段大小相符。重组质粒分别被HindⅢ、BamHⅠ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6kb和1.1kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及LeftyA片段大小相符。将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人LeftyA基因编码区序列完全一致。稳定转染LeftyA重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达LeftyAmRNA。结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-LeftyA真核表达载体构建成功,并建立了LeftyA稳定表达细胞系。

VR1受体稳定真核表达细胞系的建立

[目的 ]为研究VR1(Vanilloidreceptorsubtype1)受体的功能 ,建立VR1稳定真核表达细胞系。 [方法 ]采用RT -PCR的方法从大鼠脊髓克隆VR1cDNA ,并构建VR1表达载体。将VR1质粒通过电穿孔方法转染HEK2 93细胞 ,经G4 18筛选获得稳定表达的细胞克隆。采用RT -PCR、Westernblotting、免疫荧光、细胞Ca2 +浓度测定等方法检测VR1受体的表达。 [结果 ]筛选的阳性细胞克隆含有VR1的mRNA及蛋白质 ,细胞Ca2 +浓度的改变提示VR1受体的功能性表达。 [结论 ]建立了稳定表达VR1受体的真核表达细胞系。

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。

过渡型CK19阳性表达细胞——一种新的可能的肝癌前病变的标志

目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织过渡型CK19阳性表达细胞与肝癌前病变变的关系。方法 用LSAB免疫组化染色方法观察慢性乙型肝炎患者肝组织CK19的表达,并对患者每3个月检查B超和血清AFP,随访至1年。结果 肝组 织出现卵圆细胞分化为肝细胞的过渡型CK19阳性表达细胞的患者大多数出现血清AFP的明显升高,随访至1年,有1例患者出现小肝癌,1例出现肝实质低回声结节。结论 过渡型CK19阳性表达细胞可作为一种新的可能的肝癌前病变的病理学标志。

人EPO高效表达细胞株的筛选与鉴定

用氨甲喋呤 (MTX)对稳定转染人促红细胞生成素 (EPO)基因的CHOˉ(DHFR缺陷型 )细胞株进行梯度加压 ,并使用α -MEM培养基进行培养 ,使DHFR基因在CHOˉ细胞中大量扩增 ,从而使EPO的表达量提高。经检测分析EPO的表达量 ,筛选出EPO高效表达的细胞株。结果表明 ,用MTX加压到 16× 10 - 7mol l和 6 4× 10 - 7mol l浓度时 ,收集的细胞培养液经 (NH4 ) 2 SO4 盐析、透析等处理得到EPO抽提液 ,经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测出与标准品相对应的一条带 ,WesternBlot证明该带确为EPO。

正常年轻恒牙髓中HLA-DR抗原表达细胞的免疫组织化学研究

目的 探讨正常年轻恒牙发育过程中HLA -DR阳性细胞阳性细胞抗原呈递细胞的变化特点 ,为HLA -DR参与牙髓局部免疫防御及生长发育提供重要的理论基础 ;为临床上选择保存活髓的时机提供实验依据。方法 用免疫组织化学染色的方法标记牙髓HLA -DR阳性细胞 ,并进行定量研究。结果 根尖孔的闭合组与未闭合组的牙髓组织中均存在HLA -DR阳性细胞 ,闭合组阳性细胞数少于未闭合组阳性细胞数 (P <0 0 5 )。结论 正常年轻恒牙牙根发育的不同阶段牙髓中均存在HLA -DR阳性牙髓树突状细胞 ,呈递外界抗原产生免疫应答 ,保证了牙齿的正常发育 ;随着牙根尖孔的闭合 ,髓腔的减小 ,HLA -DR细胞数量下降 ,保持自身稳定 ,维持牙髓的生理平衡。

二型谷氨酸羧肽酶稳定表达细胞株的建立

为了深入研究二型谷氨酸羧肽酶 (glutamatecarboxypeptidaseⅡ ,GCPⅡ )功能和了解其在兴奋性氨基酸代谢过程中作用 ,拟构建GCPⅡ的表达载体 ,建立稳定表达细胞株 ;采用聚合酶链反应 ,酶切连接 ,和蓝白筛选的方法 ,构建表达载体 ;磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株。采用PCR方法扩增出GCPⅡ ;构建含有GCPⅡ基因的表达载体———pcDNA3 1 NA ;建立了细胞株HEK 2 93 NA。成功构建了GCPⅡ的表达载体 ,建立了稳定表达细胞株 ,为深入研究该酶的功能和兴奋性氨基酸毒性作用奠定了基础。

糖蛋白激素LGR6的结构分析及其表达细胞株的建立

L GR6是新近分离出来的糖蛋白激素受体家族的新成员 ,对分离出来的全长 c DNA及其编码的蛋白质序列初步分析结果显示 ,该受体属于富含亮氨酸重复序列的 G-蛋白偶联受体。c DNA编码一个 977个氨基酸组成的多肽链 ,没有信号肽 ,跨膜区域长为 2 64个氨基酸 ,受体的胞外区域含有 16个 LRR。组织分布的研究显示 ,该受体广泛表达于人体各组织 ,但骨骼肌中没有检测到。该受体在蛋白水平上与 L GR5有 5 1%的同源性。为进一步研究受体的功能 ,我们利用脂质体 DAC-3 0转染 HEK2 93细胞 ,建立了稳定表达 L GR6的细胞株 ,用于今后的研究 ,包括天然配基的分离。

肿瘤高表达细胞周期相关蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的研究肿瘤高表达细胞周期相关蛋白(CREPT)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织及相应癌旁组织中的表达,探讨其在肺癌中的作用及临床意义。方法收集271例NSCLC组织,采用免疫组织化学方法检测NSCLC组织以及癌旁组织中CREPT的表达。结果 CREPT在NSCLC组织中表达阳性率为96.1%,明显高于在癌旁组织的表达率(30.4%);CREPT表达与年龄、肿瘤大小无关,CREPT在低分化肿瘤组织表达增强;CREPT在总NSCLC样本的不同临床分期间表达有显著性差异;在总NSCLC、有淋巴结转移的腺癌组织中,CREPT表达明显增强;鳞癌CREPT的表达与淋巴结转移无明显关联。结论CREPT在NSCLC不同病理分级间表达存在差异,有淋巴结转移的腺癌组织CREPT表达增强。

睾丸特异蛋白GGN1稳定表达细胞株的建立

GGN1是1种功能未知的睾丸特异表达蛋白,它是睾丸特异性基因Ggn的表达产物。Ggn 基因的原初转录产物有多种剪接方式,并最终翻译产生3种蛋白,GGN1就是其中的1种。研究 发现Ggn的表达与精子的生成过程紧密相关。GGN1还可以与多种蛋白相互作用,其中包括 FANCL,GGNBP1,GGNBP2和OAZ3。为了能够在体外更方便的研究Ggn及其相关基因的功能,通 过脂质体转染和G418加压法筛选获得了能稳定表达pEGFP-N2／GGN1的CHO-K1细胞株。

鸡APOBEC4稳定表达细胞系的建立与应用

鸡APOBEC4是最新发现的载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)家族成员,功能尚不明确。由于具有保守的胞苷脱氨酶基序,该家族蛋白能够诱导机体DNA或RNA发生广泛的胞嘧啶脱氨基突变,参与到机体免疫过程中去,在机体先天性免疫与适应性免疫中均发挥重要作用。这种RNA编辑作用亦可诱导病毒基因组突变,产生种类众多的突变株,但由于每种突变在群体中的比例极小,自然状态下会被优势准种掩盖难以检测,因此需要能够稳定表达该蛋白的细胞系作为模型进行研究。本实验室前期结果表明,鸡源APOBEC4主要在免疫细胞中表达,而传染性支气管炎病毒、流感病毒感染能够显著刺激鸡APOBEC4的大幅上调。为研究鸡APOBEC4编辑作用对病毒复制的影响,本研究利用慢病毒包装方法,将鸡源APOBEC4基因导入BHK21细胞,通过Real-time quantitative PCR和Western blot方法进行鉴定,得到能够稳定表达鸡APOBEC4的BHK21细胞系BHK21-APOBEC4,并发现鸡传染性支气管炎病毒(IBV)Beaudette株和禽流感病毒(AIV)H9N2株在该细胞系上的复制较对照组受到显著抑制,为进一步研究APOBEC4的生物学功能奠定基础。

糖皮质激素受体对肾小球系膜细胞表达细胞间黏附分子1的影响

目的:探讨糖皮质激素(GC)对TNF-α诱导后MC表达细胞间黏附分子(ICAM-1)增加的抑制作用,以及糖皮质激素受体(GR)阻断剂对其的影响。方珐:雄性SD大鼠25只,分离并培养肾小球系膜细胞。对照组,MC用生理盐水处理24 h;TNF-α组,MC用TNF-α(终浓度为100 U/ml)处理24 h;TNF-α+Dex组,MC用TNF-α(终浓度同上)和Dex(终浓度为10-8mol/L)

IL-13等因素对肾小球系膜细胞表达细胞周期调节负控蛋白p27的影响

目的 :探讨IL 13、ET 1、甲基强的松龙及肝素钠对肾小球系膜细胞表达细胞周期负控蛋白p2 7的变化。方法 :不同浓度IL 13 (10ng/mL、10 0ng/mL)、ET 1(10 7mol/L)、甲基强的松龙 0 5μg/mL、肝素钠 2 0 0mg/L和10 0 μg/L ,作用于培养的系膜细胞。流式细胞仪检测p2 7表达水平。结果 :IL 13 10ng/mL浓度组和 10 0ng/mL浓度组p2 7表达为 46 74± 3 2 5和 2 3 8± 2 56,与对照组比较差异有显著意义 (P <0 0 0 1,P <0 0 5) ,两不同浓度组之间差异有显著意义 (P <0 0 1)。ET 1刺激 14h和 18h后p2 7的表达分别为 14 76± 1 49和 12 18± 1 3 0 ,与对照组比较差异均有显著意义 (P <0 0 5,P <0 0 5)。甲基强的松龙 48h及 72h后p2 7表达为 9 9± 1 0 1和 9 12±0 93 ,与对照组比较明显降低 ,P <0 0 0 1。肝素钠 10 0mg/L浓度组和 2 0 0mg/L浓度组p2 7的表达分别为 2 6 94±1 2 3和 2 8 0 4± 0 99,较对照组明显升高 (P <0 0 5) ,不同浓度组间比较无明显差异。结论 :肾小球系膜细胞受不同因素作用后细胞周期调节负控蛋白p2 7表达水平不同。p2

转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立

通过细胞转染、药物筛选等方法,获得Flag-E2F1和Flag-E2F1E132稳定表达的HeLa细胞株,用蛋白印迹杂交和细胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。结果表明,本研究构建了Flag-E2F1和Flag-E2F1E132稳定表达的HeLa细胞株,这些稳筛细胞株对于进一步寻找E2F1的关键下游靶基因十分重要。

黄酮类化合物影响大麻素受体过表达细胞中cAMP含量的初步研究

目的·初步探讨黄酮类化合物对大麻素受体(CBR)过表达细胞中环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响。方法·构建重组表达质粒GV144-CB1R和GV144-CB2R;转染HEK-293细胞建立CBR过表达细胞模型,研究黄酮类化合物对CBR过表达细胞中cAMP含量的影响。结果·成功构建CBR过表达细胞模型。化合物作用结果显示,所测试的化合物在测试浓度下均可使过表达CBR的HEK-293细胞中c AMP含量显著降低,且对CB2R过表达的细胞有一定选择性。结论·该研究所使用的黄酮类化合物都可以在μmol/L浓度下降低CBR过表达细胞中cAMP的含量。

稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。