勘误:EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2009年第25卷第11期第1013-1015页的“EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定”论文中,图2A及图3用错了荧光显微镜和流式细胞术的图像。

DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其生物学特性鉴定

目的为研究肺癌发生机制中DNA氧化损伤修复基因HOGG1的可能作用,利用携带有HOGG1特异性锤头状核酶基因的载体与肺腺癌A549细胞株,建立HOGG1低表达细胞株并观察其生物学效应。方法HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体[pcDNA3.1(+)RZ]经脂质体介导转染A549细胞;G418筛选;Neo基因的RTPCR法鉴定阳性克隆细胞;RTPCR半定量检测核酶对HOGG1基因的抑制效应。同时比较转染细胞与正常A549细胞的生长情况、细胞周期、软琼脂克隆形成率以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果转染后G418成功筛选出了阳性转化克隆,经传代形成稳定细胞株。核酶可持续抑制A549细胞HOGG1基因的表达,RTPCR结果显示转染细胞HOGG1mRNA的表达比正常A549细胞低61.5%(P<0.05);转染后,细胞株形态无明显改变;其群体细胞倍增时间为2.05天,稍短于正常A549细胞(2.17d);细胞周期各时相及细胞凋亡率以及细胞增殖指数没有明显改变(P>0.05);软琼脂克隆形成抑制率接近50%(P<0.05);SOD活力比正常A549细胞显著增加(P<0.05)。结论成功建立HOGG1低表达细胞株,所观察的生物学效应多数指标与正常A549细胞无显著差异。

人EPO高效表达细胞株的筛选与鉴定

用氨甲喋呤 (MTX)对稳定转染人促红细胞生成素 (EPO)基因的CHOˉ(DHFR缺陷型 )细胞株进行梯度加压 ,并使用α -MEM培养基进行培养 ,使DHFR基因在CHOˉ细胞中大量扩增 ,从而使EPO的表达量提高。经检测分析EPO的表达量 ,筛选出EPO高效表达的细胞株。结果表明 ,用MTX加压到 16× 10 - 7mol l和 6 4× 10 - 7mol l浓度时 ,收集的细胞培养液经 (NH4 ) 2 SO4 盐析、透析等处理得到EPO抽提液 ,经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测出与标准品相对应的一条带 ,WesternBlot证明该带确为EPO。

二型谷氨酸羧肽酶稳定表达细胞株的建立

为了深入研究二型谷氨酸羧肽酶 (glutamatecarboxypeptidaseⅡ ,GCPⅡ )功能和了解其在兴奋性氨基酸代谢过程中作用 ,拟构建GCPⅡ的表达载体 ,建立稳定表达细胞株 ;采用聚合酶链反应 ,酶切连接 ,和蓝白筛选的方法 ,构建表达载体 ;磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株。采用PCR方法扩增出GCPⅡ ;构建含有GCPⅡ基因的表达载体———pcDNA3 1 NA ;建立了细胞株HEK 2 93 NA。成功构建了GCPⅡ的表达载体 ,建立了稳定表达细胞株 ,为深入研究该酶的功能和兴奋性氨基酸毒性作用奠定了基础。

糖蛋白激素LGR6的结构分析及其表达细胞株的建立

L GR6是新近分离出来的糖蛋白激素受体家族的新成员 ,对分离出来的全长 c DNA及其编码的蛋白质序列初步分析结果显示 ,该受体属于富含亮氨酸重复序列的 G-蛋白偶联受体。c DNA编码一个 977个氨基酸组成的多肽链 ,没有信号肽 ,跨膜区域长为 2 64个氨基酸 ,受体的胞外区域含有 16个 LRR。组织分布的研究显示 ,该受体广泛表达于人体各组织 ,但骨骼肌中没有检测到。该受体在蛋白水平上与 L GR5有 5 1%的同源性。为进一步研究受体的功能 ,我们利用脂质体 DAC-3 0转染 HEK2 93细胞 ,建立了稳定表达 L GR6的细胞株 ,用于今后的研究 ,包括天然配基的分离。

睾丸特异蛋白GGN1稳定表达细胞株的建立

GGN1是1种功能未知的睾丸特异表达蛋白,它是睾丸特异性基因Ggn的表达产物。Ggn 基因的原初转录产物有多种剪接方式,并最终翻译产生3种蛋白,GGN1就是其中的1种。研究 发现Ggn的表达与精子的生成过程紧密相关。GGN1还可以与多种蛋白相互作用,其中包括 FANCL,GGNBP1,GGNBP2和OAZ3。为了能够在体外更方便的研究Ggn及其相关基因的功能,通 过脂质体转染和G418加压法筛选获得了能稳定表达pEGFP-N2／GGN1的CHO-K1细胞株。

转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立

通过细胞转染、药物筛选等方法,获得Flag-E2F1和Flag-E2F1E132稳定表达的HeLa细胞株,用蛋白印迹杂交和细胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。结果表明,本研究构建了Flag-E2F1和Flag-E2F1E132稳定表达的HeLa细胞株,这些稳筛细胞株对于进一步寻找E2F1的关键下游靶基因十分重要。

蛋白药物开发高表达细胞株筛选技术的进展

常见的真核表达细胞包括Chinese hamster ovary （CHO）,mouse myeloma（NS0）,baby hamster kidney（BHK）,human embryo kidney（HEK-293）,其中最重要的是CHO细胞,以CHO dihydrofolate reductase （DHFR）系统[1]和CHOglutamine synthetase （GS）系统[2]为主.获得产量高、稳定、生长快等优良特征的克隆用于生产蛋白药物或蛋白抗体的细胞系是一项具有挑战性的工作.转染细胞在抗生素药物筛选后,使用MTX（CHO DHFR）系统和MSX（CHO GS）系统进一步筛选得到转染阳性细胞集群.本文介绍几种常见的从上述的细胞集群里获得高表达细胞株的方法,由于流式细胞仪逐渐成为实验室的常规仪器,本文以流式细胞仪在这方面的应用为主加以介绍。

N-乙酰氨基半乳糖转移酶3高表达细胞株的建立及其对细胞迁移的影响

蛋白质异常糖基化是导致细胞黏附、肿瘤转移和血管生成的重要因素[1-2].N-乙酰氨基半乳糖转移酶3（GalNAc-T3）能够催化N-乙酰氨基半乳糖连接到蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上,是黏蛋白型O-糖基化修饰的起始糖基转移酶.我们前期的研究成果显示,在低表达GalNAc-T3肺腺癌组织内,肿瘤细胞分化程度较低,预后较差[3].我们利用慢病毒载体,构建高表达GalNAc-T3肺腺癌A549细胞株,观察GalNAc-T3的表达对肺腺癌转移的影响.

稳定表达携带SFB标签的猪圆环病毒2型Cap蛋白细胞株的构建及其凋亡活性检测

为建立稳定表达携带SFB标签的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的细胞株并研究其诱导凋亡活性,本研究利用Gateway系统构建真核表达载体p DEST-SFB-ORF2,转染PK15细胞,嘌呤霉素抗性筛选,western blot和免疫共沉淀试验鉴定,获得2株稳定表达携带SFB标签的Cap蛋白的PK15细胞株。间接免疫荧光检测发现重组Cap蛋白在部分细胞内呈点状荧光分布,可能形成病毒性颗粒;流式细胞仪检测表明Cap蛋白的表达可诱导PK15细胞凋亡。本研究成功表达携带SFB标签的PCV2 Cap蛋白,并验证了其诱导凋亡活性,同时为下一步通过串联亲合纯化/质谱方法鉴定Cap蛋白的互作蛋白研究奠定基础。

呼吸道合胞病毒M2-1蛋白Hep-2细胞稳定表达株的构建及其在呼吸道合胞病毒感染中的特点

目的:构建稳定表达呼吸道合胞病毒(RSV)M2-1蛋白的Hep-2细胞,并分析稳定表达细胞株RSV感染的特点。方法:构建M2-1真核表达质粒,转染至Hep-2细胞。通过G418筛选阳性单克隆;RT-PCR、qRT-PCR以及Western blot鉴定,最终得到稳定表达株。通过MTT法分析细胞增殖特征;通过分析不同浓度RSV病毒感染Hep-2细胞与所构建的稳定表达株细胞后在状态、细胞病变(CPE)出现时间以及RSV基因组核酸产量分析比较RSV在两种细胞中的感染特点。结果:获得一株稳定表达M2-1蛋白的细胞Hep-2 2F5。该株细胞的生长速度高于原始细胞株。采用1000~10?2 TCID50 (E1~E6)的病毒滴度对Hep-2 2F5与Hep-2两种细胞进行感染发现,1000 TCID50 (E1)的滴度下,两种细胞均产生病变,但Hep-2 2F5细胞产生的病变更明显;100~10 TCID50 (E2~E3)滴度下RSV感染两种细胞,Hep-2 2F5细胞产生的病变更早且更明显;1~0.1 TCID50 (E4~E5)滴度下RSV感染两种细胞,Hep-2 2F5细胞产生少量病变,Hep-2则无明显病变。E1~E4滴度下攻毒12 h后,RSV在Hep-2 2F5细胞中的核酸定量平均值高于Hep-2细胞,E5~E6滴度下攻毒12 h两细胞均未检测到RSV病毒核酸;随着时间延长,E1~E2滴度感染后的Hep-2中RSV含量高于Hep-2 2F5,在E4滴度及以下,RSV在Hep-2 2F5中的增殖优于Hep-2。结论:成功构建稳定表达M2-1蛋白的Hep-2 2F5细胞株。该细胞株在RSV感染中更具敏感性,低滴度病毒感染的情况下,更早产生CPE效应,且病毒核酸的含量也较Hep-2高。

人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定

目的:构建人程序性死亡配体1(PD-L1)重组质粒载体,筛选稳定高表达人PD-L1的结肠癌单克隆细胞株。方法:提取HCT116细胞总RNA,RT-PCR克隆PD-L1基因片段,将其重组至含有HA标签和Neo真核细胞筛选抗性的pc DNA3质粒载体上,转染HCT116细胞,倍比稀释8个细胞浓度至96孔板,G418筛选两周,挑取单细胞克隆,通过免疫印迹鉴定外源性PD-L1的表达;通过MTS、Transwell和软琼脂细胞克隆形成实验比较PD-L1低表达和高表达单克隆细胞株生长增殖、迁移和细胞克隆形成能力的差别;最后通过在两组细胞中过表达帽依赖性荧光素酶报告基因阐述造成上述表型的可能机制。结果:成功构建人PDL1的真核表达载体,并筛选获得稳定高表达PD-L1的HCT116单克隆细胞株。功能研究初步证明PD-L1可促进细胞克隆形成能力、迁移和生长增殖。过表达PD-L1可使帽依赖性荧光素酶报告基因的表达上调约3~4倍,表明其机制部分为PD-L1可上调帽依赖性蛋白质翻译。结论:获得了PD-L1重组质粒载体及可用于后续功能研究的稳定高表达人PD-L1的HCT116单克隆细胞株。

药用植物细胞的大规模培养技术

对药用植物细胞和器官进行大规模培养生产各种次生代谢药物的技术进行了简要介绍。

稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞系的建立

为了探索猪瘟病毒非结构蛋白5A(NS5A)的功能,成功扩增了猪瘟病毒NS5A基因的DNA片段并构建了猪瘟病毒NS5A基因的重组表达质粒pGFP-NS5A和pNS5A-GFP。然后,将阳性质粒pGFPNS5A、pNS5A-GFP和对照质粒pEGFP-C1在Lipofectamine 2000介导下转染猪血管内皮细胞(SUVEC),活细胞状态下直接观察GFP-NS5A和NS5A-GFP蛋白在SUVEC细胞中的表达与定位。结果显示,猪瘟病毒NS5A蛋白主要定位于细胞质中;进一步的激光共聚焦共定位显示,NS5A蛋白主要定位于SUVEC细胞的内质网上面。在此基础之上,通过含有1 500μg/mL新霉素(G418)的抗性培养基筛选出稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞克隆。RT-PCR和Western-blot检测结果表明,猪瘟病毒NS5A蛋白可以在SUVEC细胞中稳定转录和表达。上述结果表明,本研究建立了稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的SUVEC细胞株,为进一步研究NS5A蛋白对SUVEC细胞的生理功能的影响及其在猪瘟病毒致病过程中的作用奠定了基础。

Toll样受体4基因突变体过表达慢病毒的构建及鉴定

Toll样受体4（TLR4）基因2287T突变体则是我们在中国人中鉴定发现的一种有义突变，为研究该突变体的功能，我们构建了其过表达慢病毒及稳定表达细胞株。