基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pc DNATM3.1/myc-His A构建其真核表达质粒pc DNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法(western blotting)检测目的基因表达。结果显示,pc DNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33c DNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因c DNA,并构建其真核表达质粒。

抗卵巢癌单链免疫细胞因子真核表达载体的构建及表达

为将细胞因子IL 2靶向卵巢癌局部 ,提高肿瘤局部细胞因子的浓度 ,构建并表达了抗卵巢癌单链免疫细胞因子IL 2 1 83B2scFv .通过基因工程将两段基因IL 2和 1 83B2scFv开放读码框架的编码序列克隆在一起 ,在CHO细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白 .酶联免疫吸附法检测其免疫学活性 ,并检测其促淋巴细胞增殖活性 .构建成功的抗体细胞因子融合蛋白能够在哺乳动物细胞内表达并能分泌到细胞外 ,且融合蛋白既能与卵巢癌相关抗原OC1 83B2很好地结合 ,又能刺激IL 2依赖细胞株的增殖 。

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。

鸡Elovl2基因组织表达谱及脂代谢功能研究

为探究Elovl2基因在鸡体内的生物学功能,对鸡ELOVL2蛋白的理化性质进行分析,通过RT-qPCR技术检测该基因在鸡各组织中的表达情况。将Elovl2基因过表达重组质粒与最佳干扰片段分别转染鸡LMH细胞系,通过RT-qPCR技术检测Elovl2基因及脂代谢相关基因mRNA水平的变化,利用GC-MS技术检测细胞内相关脂肪酸含量的变化。结果显示:鸡ELOVL2蛋白属于稳定蛋白,该基因mRNA主要表达于脑和肝脏组织。转染pcDNA3.1-Elovl2后,基因相对表达水平显著上升,过表达重组质粒构建成功。三组siRNA均显著抑制Elovl2基因表达,抑制效果最佳的为siRNA-681。抑制Elovl2基因表达后,pck1基因的表达量较对照组相比上升2倍,但二者差异不显著。过表达Elovl2基因后,各种脂肪酸含量均有所增加,而经RNAi技术抑制Elovl2基因表达后,各种脂肪酸则有不同程度减少,受其影响最明显的为C22∶1N9。试验结果为进一步研究鸡Elovl2基因的功能奠定了基础。

AY358935基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3．1-Ay真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3．1-Ay瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di_phenytetrazoliumromide，MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3．1诅y克隆区酶切片段-致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、peDNA3．1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值（0．74）也明显高于其余两组（0．39和0．46），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3．1-Ay构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。

冠突散囊菌nsdD基因超表达菌株的构建及表型分析

为了研究冠突散囊菌nsdD基因的功能,本研究将冠突散囊菌nsdD的cDNA置于强启动子三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA下游及色氨酸合成酶C基因终止子TtrpC上游构建nsdD基因超表达载体PURT5750,采用根癌农杆菌介导方法将表达质粒PURT5750转化到冠突散囊菌进行功能验证。结果显示向基因组随机插入外源质粒DNA,随机挑选11个nsd D基因超表达转化子,对nsdD基因超表达转化子菌株培养观察并与野生型菌株相比发现,在5%和17%NaCl培养基中菌落差异不显著,而且仍能产生成熟的有性孢子。本实验为冠突散囊菌有性发育调控机制的研究提供了技术基础。

PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库

针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型（PDM）,在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95%。