论转基因动物表达重组蛋白

转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。在这些表达器官中,通过构建合适的载体,选择适当的启动子和调控序列可产生比正常水平高得多的重组蛋白。

基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2为基础,通过添加T7 RNA聚合酶编码基因及人工合成的克隆表达区,构建了1个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体pAU29KS。pAU29KS载体克隆/表达盒使用T7启动子作为目的基因的启动子,通过载体序列中T7 gene 1基因编码的T7 RNA聚合酶与T7启动子互作来进行目的基因的高效转录;启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点RBS保守序列(gaaagga)来高效起始目的蛋白合成;克隆/表达盒RBS与多克隆位点MCS之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽cgl_2070编码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyF作为报告蛋白,进行谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pAU29KS表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示,工程菌株C.glutamicum/pAU29KS-amyF能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈;培养物上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带,与AmyF预测分子量相一致;淀粉酶活性检测结果显示,培养物上清液呈现高淀粉酶活力,而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力,说明高效表达的α-淀粉酶在强信号肽cgl_2070的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于T7转录系统的C.glutamicum/pAU29KS能够对目标蛋白进行高效分泌生产,是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。

重组胶原蛋白表达体系研究进展

胶原蛋白是哺乳动物中含量最多的蛋白质,至今已发现28种类型,主要分为纤维性胶原蛋白、网状胶原蛋白、珠状丝状胶原蛋白、锚定纤维蛋白、膜蛋白以及multiplexins胶原蛋白,其中纤维性胶原蛋白中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白占人体胶原蛋白的80%~90%。目前,根据来源,胶原蛋白大致分为动物源胶原蛋白和重组胶原蛋白。动物源胶原蛋白主要来源于陆生动物以及海洋动物,而重组胶原蛋白是指将人胶原蛋白基因克隆到选定的表达载体并转化到表达细胞内,最后通过纯化技术所获得的蛋白质。本文简述了胶原蛋白的结构、类别和生物合成机制,重点阐述了重组胶原蛋白表达体系及特点,包括原核生物、酵母、植物、杆状病毒以及哺乳动物细胞等表达体系及其优势与局限性,介绍了重组胶原蛋白市场前景及在眼科、软骨工程、皮肤治疗等生物医药方面的实际应用,并对重组胶原蛋白的研究和产业发展进行了展望。

重组融合蛋白GX1-rmhTNFα的克隆、表达及鉴定

目的构建胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子(GX1-rmhTNF)基因的原核表达载体,表达GX1-rmhTNF蛋白。方法利用基因工程方法将胃癌血管特异性结合肽融合在新型人肿瘤坏死因子α的氨基末端,构建GX1-rmhTNF原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析。结果成功构建了GX1-rmhTNF重组融合表达质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量(Mr)约18000处出现了1条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TNFα单克隆抗体特异性的结合能力。结论成功构建了GX1-rmhT-NF基因的原核表达载体并在原核细胞中表达了该产物,为下一步GX1-rmhTNF的纯化奠定了基础。

基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术

抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品，其特异性高、均一性好、靶点明确，广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗。目前，在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中，肿瘤类疾病占32％、免疫性疾病占37％、器官移植疾病占11％、感染性疾病占8％、心血管疾病占4％、其他疾病占6％。

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。

光敏生物素标记IgG检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒囊膜蛋白及重组表达蛋白

用光敏生物素标记从兔抗羊接触传染性脓疱性皮炎病毒超免疫血清中提取纯化的IgG ,把从蔗糖密度梯度离心纯化的病毒用 2 ME和NP4 0裂解后与重组转化菌 pGRL 4A和pGRH 3A一起进行SDS PAGE ,并进行转移电泳。对用光敏生物素标记的IgG进行Western blot ting印迹杂交检测。结果 ,检测到产生IgG的病毒囊膜蛋白有 5条 ,分子量分别为 12 5 .0、96 .0、83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;检测到重组菌 pGRL 4A和 pGRH 3A可表达分泌其中的 3条囊膜蛋白 ,其分子量分别为 83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;pGRL 4A的表达较强 ,对 4 2 .0ku蛋白的分泌量最高。所重组的病毒DNAHindⅢ

快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法。首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,得到具有不同植酸酶或木聚糖酶表达水平的重组菌株,分别检测不同菌株的EGFP与重组蛋白的表达水平;最后,利用分选型流式细胞仪,根据绿色荧光值的高低对包含不同植酸酶表达水平的重组菌株的菌群进行分选。结果显示重组菌株中EGFP的荧光值与重组蛋白的活性表达水平之间具有良好的线性相关性(0.8<|R|<1),且利用流式细胞仪可高效地从混合菌群中筛选得到高产菌株,所分选得到的高荧光菌株在摇瓶发酵120 h时植酸酶表达水平是低荧光菌株的4.09倍。本方法通过检测菌株的EGFP荧光值代替检测重组蛋白的表达水平和活性,从而实现高表达菌株的筛选,大大提高了其应用的便捷性及通用性。与流式细胞仪、液滴微流控等高通量筛选仪器或技术结合将进一步提高筛选的速度与通量,为筛选获得高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株提供了简便、快速的新途径。

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2.1基因(yellowcameleon2.1)导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器(房室化现象),所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。

家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.

中华大蟾蜍EDF-1重组蛋白的原核表达、纯化及抗血清的制备

通过实验获得中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)内皮分化相关因子-1(Endothelial differentiation related factor-1,EDF-1)重组蛋白及高效价抗血清。在前期研究工作中已克隆中华大蟾蜍EDF-1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)(GenBank登录号K F769459),但因密码子的偏好性使中华大蟾蜍原有密码子在原核细胞中发生识别困难,重组蛋白原核表达未能成功。本文对中华大蟾蜍的EDF-1的ORF进行密码子优化,委托公司合成并插入原核表达载体,构建重组质粒pET-28b-EDF-1-Bufo。将重组质粒转入大肠杆菌(E. coli)感受态细胞BL21(DE3),使用IPTG诱导重组蛋白表达,钴胶纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白免疫小鼠制备鼠抗重组中华大蟾蜍EDF-1的抗血清,然后通过Western-blot和ELISA检测抗血清的特异性及其效价。重组中华大蟾蜍EDF-1得到良好表达,抗血清特异性良好,效价为1∶8 000。为进一步研究EDF-1的生物学功能奠定基础,同时为研发抑制内皮细胞分化相关的抗肿瘤药物提供重要参考。

胃癌患者淋巴结转移、病情进展与Tspan-1表达水平的相关性

目的观察胃癌患者淋巴结转移、病情进展与四旋蛋白1重组蛋白(Tspan-1)表达水平的相关性,以便为临床治疗提供参考价值。方法选取福建省莆田市第一医院在2018年1月至2021年6收治的150例胃癌根治术患者作为研究对象,根据术后病理情况分为淋巴结转移组(LN组,n=120例)与无淋巴结转移组(NLN组,n=30例),采用问卷调查法收集两组一般资料,并对其进行logistic多因素分析和Pearson相关性分析,评估影响胃癌根治术后患者淋巴转移的相关危险因素及相关性情况。结果150例患者中共120例患者出现淋巴结转移,经调查可知,LN组严重疾病病情进展发生率高于NLN组(P<0.05);比较两组患者一般资料,NLN组肿瘤浸润深度、是否存在溃疡、肿瘤直径、肿瘤分型及年龄因素与LN组比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者癌组织中Tspan-1蛋白表达水平均低于癌旁组织,且LN组癌组织中Tspan-1蛋白表达水平高于NLN组(P<0.05);logistic回归分析结果显示,肿瘤分型为未分化型、肿瘤浸润深度至浆膜层、存在溃疡与Tspan-1高表达均为胃癌患者淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05);且经Pearson相关性分析可知,淋巴结转移、疾病进展分别与Tspan-1表达水平呈正相关(r>0,P<0.05)。结论导致胃癌根治术后患者淋巴结转移的主要影响因素为Tspan-1高表达水平,且还与患者术后病情进展风险高度相关。

重组人血清白蛋白的表达

人血清白蛋白(Human Serum Albumin,简称HSA)是人血浆中主要的蛋白质,其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸,分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L,约占血浆总蛋白的60％。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素。

猪细小病毒VP2重组蛋白的诱导表达及表达产物的纯化

将构建好的重组质粒转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了VP2蛋白主要抗原域的高效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式;经滤膜、饱和硫酸铵、Ni-NTA树脂层析进行纯化。结果表明:重组质粒得到高效诱导表达,并且重组蛋白以包涵体的形式存在;获得高纯度的重组蛋白。

单细胞激光拉曼光谱检测重组大肠杆菌细胞表达甲酸脱氢酶

甲酸脱氢酶(FDH,EC1.2.1.2)在工业生产中有重要的应用价值,工业上应用的FDH可以通过构建高水平表达重组FDH蛋白的基因工程菌生产,用分子生物学的方法检测重组蛋白的高效表达和积累操作繁杂,耗时耗力且需要破碎细胞。为了寻找一种简单快速,不需破碎细胞,且能实时检测FDH重组蛋白在基因工程菌中表达情况的方法,本研究应用单细胞激光拉曼光谱分析技术(LTRS),研究IPTG诱导不同时间后甲酸脱氢酶重组蛋白(FDH)在大肠杆菌细胞中的表达水平。结果表明,FDH的特征峰1004,1355,1455和1667cm-1随着IPTG诱导时间的延长而增强,说明在诱导培养过程中FDH重组蛋白在重组大肠杆菌细胞中表达并积累,这4个峰强的增加值所反映的FDH表达量与SDS-PAGE电泳分析结果一致。实验结果证明,LTRS是快速有效检测单个大肠杆菌活细胞体内重组FDH实时表达的一种非入侵方法。

A群猪轮状病毒VP6结构蛋白在杆状病毒系统中的表达及鉴定

为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆状病毒杆粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rBac-PoRVA-VP6,经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示,表达的PoRVA重组VP6蛋白约45 ku,并且能够被PoRVA阳性血清识别。上述结果表明,经杆状病毒表达系统表达的重组VP6蛋白具有良好的反应原性,为建立PoRVA抗体检测技术奠定了基础。

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。