EIAV gp45和HIV gp120基因在不同表达系统中表达效果比较

马传染性贫血病毒(EIAV)gp45基因编码跨膜蛋白TM,该蛋白在介导病毒与靶细胞之间的融膜过程中起关键作用。gpl20蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)的外膜糖蛋白,是病毒的主要抗原。通过大肠杆菌原核表达系统和果蝇细胞真核表达系统分别表达gp45及gp120,并对其表达效果进行对比,结果表明:在大肠杆菌表达系统中,gp45可成功表达,而gp120却不能表达。在真核表达系统中,gp120成功表达,而gp45却未能表达。通过对这两种系统表达情况效果的比较,发现gp45在原核系统中表达有利,而gp120在真核系统中表达有优势,表明这些基因的表达具有特异性,本研究指导我们根据特定的基因选用适当的表达系统,以便纯化所需的目的蛋白,同时也为深入研究HIV的包膜蛋白的生物学结构特性及推动相关疫苗的研究奠定基础。

大豆查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆、表达及其在雪莲提取液中的代谢产物分析

以栽培大豆北丰12为材料,利用PCR方法克隆查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)全基因,采用SOE法克隆得到去掉内含子的查尔酮合成酶基因,核酸序列分析表明,该基因编码区长1170bp,编码390个氨基酸,与已报道的GMCHS8(GenBank:AY237728)的cDNA序列相似率达到97%。构建pET-GMCHS工程表达质粒,通过大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统表达大豆CHS。通过12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在42.9kDa的一条蛋白质特异表达带。液相色谱分析大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统在雪莲提取液中的代谢产物,样品和空白对照样对比,样品在273nm,3.0min出现新的吸收峰,质谱分析结果表明CHS利用雪莲提取液中代谢中间产物合成了新的黄酮类物质。

创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。

HAV表位抗原与HBV核心抗原融合基因的原核表达

为探讨甲肝DNA疫苗的可行性,利用DNA重组技术将甲肝病毒(HAV)复合多表位抗原基因VPX插入到乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因中,得到CVPX融合基因。将CVPX克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌中进行表达,表达的蛋白进行Western Blot及ELISA检测,结果表明:融合蛋白具有甲肝病毒表位抗原的反应原性。

创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素，对其溶血活性进行评价。并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后，调控肝癌细胞SMMC7721应激因子基因表达情况。方法构建pET28a（＋）-whA表达载体，对包涵体进行三步洗涤后，用金属亲和层析（6×HisTag）纯化重组创伤弧菌溶细胞素（rVVC），并用溶血试验验证重组蛋白活性。复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后，RT-PCR方法检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）、热休克蛋白90（HSP90）基因分泌调节情况。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度（纯度≥96％）rVVC。兔红细胞溶血试验检测表明，rVVC具有溶血活性，其活性为0．2μg／HU（溶血单位）。RT-PCR结果显示，rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力，但具有时间、剂量依赖性。结论表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90mRNA表达。提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用。