表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术及其在系统性红斑狼疮诊断中的研究进展

表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近期发展起来的针对蛋白质组学检测和研究的新技术。该技术具有高通量、高灵敏度、高效率等特点,在基础研究和临床应用方面发展迅速。系统性红斑狼疮(SLE)是最常见的自身免疫性疾病之一。临床上多采用自身抗体检测来作为SLE的辅助诊断,但尚无一种自身抗体检测同时具有高的敏感性和特异性。SELDI-TOF-MS的出现弥补了SLE早期辅助诊断的不足。本文就其原理和目前在系统性红斑狼疮早期诊断中的研究进展作一综述。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法快速测定米饭和乳制品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide

建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)法分析蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide的快速检测方法。分析了Cereulide标准物质的裂解规律,考察基质种类、点靶方式、基质溶剂和用量、激光强度等对Cereulide的质谱信号强度的影响,并进行方法学验证和实际样品检测。结果表明,选择以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质,均匀分散在50%乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)中,采用先点基质再点样品的点样方式,反射线性正离子模式下选择激光强度70%进行食品中MALDI-TOF MS筛查时,可检测到Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰,此质谱信号稳定、强度高、响应重复性好。方法学验证结果表明,Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰在5~100 ng/mL范围内线性好,相关系数(r)>0.99;方法的检出限分别为3.0 ng/g和5.0 ng/g;对米饭和牛乳样品的加标回收率为73.3%~118.2%,相对标准偏差为0.3%~10.9%(n=6)。本方法分析速度快、准确性高、灵敏度好、抗干扰能力强、无需内标即可实现对米饭和乳制品中Cereulide的批量筛查和检测。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法测定α/β-二羰基类化合物与标准瓜氨酸化肽段之间的衍生化反应活性

蛋白质瓜氨酸化是一种由生物酶调控的不可逆翻译后修饰,其与免疫相关疾病、癌症、神经系统性疾病和老年痴呆症等重大疾病的发生和发展密切相关。蛋白质的瓜氨酸化修饰丰度低、缺乏亲和标签、m/z变化小且易受同位素及脱酰胺化作用干扰,因此对蛋白质的瓜氨酸化修饰进行质谱分析面临着巨大挑战。通过对瓜氨酸侧链脲基进行化学衍生反应,可以提高瓜氨酸化肽段的m/z差值,引入亲和富集标签,可有效提高瓜氨酸化分析的灵敏度和精准度。本研究以标准瓜氨酸化肽段为研究对象,以基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为检测手段,对一系列二羰基类化合物与瓜氨酸化肽段之间的化学反应活性进行测定。在对α-二羰基类化合物的考察中发现,苯乙二醛、丙酮醛、1,2-环己二酮和1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮对瓜氨酸化肽段的衍生化效率很高,并且能够生成单一的衍生化产物;2,3-丁二酮、乙二醛与瓜氨酸化肽段之间的反应效率也很高,但会生成一系列副反应产物。在对β-二羰基类化合物的考察中发现,1,3-环己二酮、2,4-戊二酮在与瓜氨酸化肽段进行反应后,均可以产生单一的衍生化产物,但反应效率很低,不适用于瓜氨酸化肽段的化学衍生反应。实验结果表明,α-二羰基结构是实现高效、特异性瓜氨酸化肽段化学衍生反应的基础,α-二羰基类化合物中不同的侧链结构又决定了衍生化产物的结构、衍生化效率及副产物的生成。通过进一步合成含有亲和标签的α-二羰基类化合物,可以实现瓜氨酸化肽段的特异性富集和精准鉴定,有助于瓜氨酸化蛋白质及其位点鉴定的新方法开发。

应用表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术检测结直肠癌肝转移

目的寻找与结直肠癌肝转移相关的蛋白质，建立结直肠癌肝转移的血清蛋白质指纹图谱诊断预测模型。方法应用表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱（SELDI—TOF—MS）技术，对36例结直肠癌无肝转移患者和36例结直肠癌伴肝转移患者的术前空腹外周静脉血标本，进行蛋白质指纹图谱测定，运用Biomarker Wizard软件，建立结直肠癌肝转移的诊断预测模型。用44例结直肠癌患者和44例结直肠癌伴肝转移患者，对所建立的诊断预测模型进行盲法验证。结果比较36例结直肠癌无肝转移患者和36例结直肠癌伴肝转移患者的血清蛋白质，得到10个差异蛋白峰（P〈0．05），质荷比分别为2398、2814、4084、4289、4465、6422、6619、11482、11649和13714。若以P〈0．01为标准，则有3个蛋白质峰差异有统计学意义，质荷比分别为2398、2814和13714。建立终末节点数为9的诊断预测模型，其敏感性为91．7％，特异性为97．2％。验证结果显示，敏感性为75．0％，特异性为81．8％。结论运用SELDI—TOF—MS技术所建立的血清蛋白指纹图谱模型，在预测结直肠癌肝转移中具有非常高的敏感性与特异性，可望成为预测诊断工具。

运用表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术建立结直肠癌预测诊断模型

目的寻找与结直肠癌相关的蛋白质并建立结直肠癌血清蛋白指纹图谱诊断预测模型。方法随机选取结直肠癌病例36例（结直肠癌组）和疝或行胆囊择期手术的患者36例（对照组），术前静脉采血，采用弱阳离子交换蛋白质芯片（CM10），经表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱（SELDI—TOF—MS）技术测定，建立结直肠癌的血清蛋白指纹图谱诊断预测模型；选取88例结直肠癌患者和44例正常对照进行盲法验证。结果通过两组比较，得到5个差异蛋白峰，并以此建立诊断预测模型，其敏感性为100％，特异性为97．2％。盲法验证显示敏感性为71．6％，特异性为72．7％。其中质荷比为8908与13707的蛋白均存在于结直肠癌组和正常组的比较中，提示上述蛋白质与结直肠癌相关。结论运用SELDI—TOF—MS技术建立的血清蛋白指纹图谱模型对诊断结直肠癌具有较高的敏感性与特异性。质荷比为8908与13707的蛋白可能成为结直肠癌的肿瘤标记物。

表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术在急性重症胰腺炎预后相关蛋白质谱检测中的应用

目的应用蛋白芯片表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-Ms）技术检测急性重症胰腺炎不同预后相关蛋白质谱，探讨急性重症胰腺炎轻重程度及预后评估的新方法。方法用SELDI-TOF-MS方法检测浙江省人民医院2008年3月至2010年10月23例急性重症胰腺炎患者的蛋白质谱，按是否发生器官功能衰竭、胰腺脓肿、腹内压异常、死亡将全部患者分组进行蛋白指纹图谱比较。结果蛋白质峰谱特征显示，在1094U、2751U、5904U处并发胰腺脓肿（13例）的重症胰腺炎患者峰值（13．21±3．73，45．62±10．31，48．37±9．24）明显高于未并发胰腺脓肿组（70例）（4．33±1．79，8．87±3．21，4．45±1．59），差异有统计学意义，均P〈0．05。在635U并发器官功能衰竭组（11例）峰值（8．56±3．21）明显低于未并发器官功能衰竭组（12例）（37．82±12．65）；而在4103U、4187U处并发器官功能衰竭组（21．63±8．23，9．81±2．32）峰值则高于未并发器官功能衰竭组（3．32±1．29，1．14±0．49）。在4173U处并发腹内压增高组（10例）峰值（8．94±3．58）明显高于无腹内压增高组（13例）（1．97±0．73）；而在5635U处并发腹内压增高组峰值（0．62±0．23）则低于无腹内压增高组（15．78±6．34）。2例死亡患者蛋白指纹表现为血清蛋白全面合成功能减退，峰值降低。结论蛋白指纹图谱技术可筛选出有意义的生物标记蛋白，为急性重症胰腺炎并发症的早期诊断与治疗提供了新的路径，对急性重症胰腺炎预后评估具有重要意义。

应用蛋白质芯片表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术探讨胃癌远处转移的机制

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率及病死率居高不下。由于超过50%的患者诊断时已属晚期,因此根治手术切除率较低,5年生存率仅25%~30%。治疗失败的主要原因是肿瘤转移、复发。因此早期诊断、及早发现胃癌远处微小病灶、及早进行干预,将会大大提高胃癌患者的临床缓解率和长期生存率。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法同时快速测定保健食品中的降压物质

建立了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)同时快速筛查测定盐酸可乐定(HCD)、阿替洛尔(ANL)和利血平(RSP)等3种降压物质的方法。对比了不同点样方式、激光强度对3种药物信号强度的影响等因素,并进行方法学验证。结果表明,以α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)为基质,采用混合点样法,反射线性正离子模式下选择激光强度为60%进行MALDI-TOF MS检测时,3个目标物的质谱信号稳定,强度高,响应重复性好。方法学验证结果表明,3种小分子降压物质在10~100 ng/mL线性范围内线性好,相关系数(r)≥0.99,方法的筛查限(LOI)为0.005~0.25μg/g,在液体、固体和半固体3种保健食品基质中的加标回收率为67.56%~104.70%,相对标准偏差(RSDs)为0.43%~10.51%(n=3)。该方法灵敏度好,准确性高,精密度优,抗干扰能力强,有机溶剂消耗少,节能环保,尤其适用于大批量、多批次保健食品中降压物质的检测,填补了传统基质分析筛查保健食品中小分子非法添加物的空白。

表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术在血液系统疾病中的应用

表面加强激光解析电离-飞行时间-质谱技术是当前临床蛋白质组学研究中比较理想的技术平台,文章介绍该技术在评价铁代谢紊乱性疾病与Hepcidin之间关系和戈谢病与CCL18之间关系方面的应用,以及该技术在发现、诊断、治疗管理、病情判定、预后评估血栓性血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、急性移植物抗宿主病等多种血液系统疾病中的应用。

应用表面加强激光解析电离-飞行时间质谱技术建立非活动性HBsAg携带者血清蛋白质谱筛选模型

目的比较非活动性HBsAg携带者和健康人的血清蛋白标记物并建立相关筛选模型。方法用表面加强激光解析电离-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)及CM10蛋白芯片对35例非活动性HBsAg携带者、35例健康人血清样本进行分析,将获得的血清蛋白质指纹图谱用计算机软件进行比较分析,建立非活动性HBsAg携带者的比较筛选模型。结果非活动性HBsAg携带者组与健康人对照组共有28个差异有统计学意义的蛋白峰;建立诊断模型的灵敏度94%(33/35),特异度80%(28/35),准确率为87%(61/70)。结论建立的血清蛋白质指纹图谱模型能够区分非活动性HBsAg携带者与健康人,SELDI技术在诊断及特异性血液生物标志分子的筛选等方面具有较好的临床应用价值。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在新生儿β-地中海贫血筛查中的应用

目的建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术的β-地中海贫血(β-地贫)基因突变检测方法,探讨其在新生儿β-地贫筛查中的临床价值。方法收集新生儿脐血DNA样本515例,针对中国人群中常见的10种β-地贫基因突变类型,分别设计一套PCR引物和延伸反应引物。待测样本经PCR和延伸反应后,所得产物用Sequenom Mass Array飞行时间质谱仪进行检测,根据质谱图中的峰值确定每份样本的基因型,并用反向点杂交进行验证。结果 515份样本10个突变位点的总判读成功率为99.55%,检测结果与反向点杂交结果完全一致;共检出β-地贫14例,均为突变杂合子,阳性检出率为2.72%;其中,基因型CD41-42/N 6例,CD17/N 5例,IVS-Ⅱ-654/N 2例,CD71-72/N 1例。结论 MALDI-TOF MS技术准确性高,检测时间短,通量高,适用于新生儿β-地贫筛查。

表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱在甲状腺癌诊断及临床分期中的应用

目的:用表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)分析正常人和甲状腺癌患者血清蛋白指纹图谱的变化,建立能鉴别正常人和甲状腺癌及Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌和Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌患者的诊断模型。方法:应用SELDI-TOF-MS技术检测72例血清标本的蛋白质质谱,其中甲状腺癌40例(Ⅰ-Ⅱ期26例,Ⅲ-Ⅳ期14例),正常人32例。应用支持向量机和判别分析的方法分析质谱数据,建立甲状腺癌诊断模型并留一法交叉验证。结果:区分甲状腺癌和正常人的诊断模型交叉检验敏感性为100%,特异性为86%,总的符合率为93%;区分Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌和Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌患者的诊断模型对Ⅰ-Ⅱ期甲状腺癌检出的敏感性为77%,特异性为86%,对Ⅲ-Ⅳ期甲状腺癌检出的敏感性为86%,特异性为77%,总的符合率为80%。结论:应用SELDI-TOF-MS技术平台和生物信息技术建立的诊断模型为甲状腺癌的早期诊断及临床分期提供了新的手段。

表面辅助激光解吸电离-飞行时间质谱中多聚体离子产生规律的研究

表面辅助激光解吸电离质谱(SALDI-MS)已经成为固态、液态样品分析的重要手段,并且分析对象逐渐由生物大分子扩展到小分子。然而,对小分子电离微观反应机理的研究仍处于起步阶段。本研究选择3种分子结构相似的稠环芳烃化合物芘、六苯并苯、红荧烯作为研究对象,考察了这3种化合物激光电离产物的差异,并研究了激光能量对六苯并苯产物离子分布的影响。结果表明,观察到芘、六苯并苯多聚体离子产物,还观测到了六苯并苯失去C_2H_2的碎片离子峰;而没有观测到明显的红荧烯聚合物离子产物,只观测到了大量失去C6H5的碎片离子峰。最后,对3种不同化合物的激光电离微观机理进行了分析。由于芘、六苯并苯具有平面大π键,分子间的π-π键相互作用是产生多聚体离子的主要原因;而红荧烯的空间位阻削弱了分子间相互作用,从而阻碍了多聚体离子的形成。

ZnO、CuO和NiO纳米颗粒在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析小分子化合物中的应用

考察了过渡金属氧化物ZnO纳米颗粒直接作为无机基质,应用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法分析糖类、硬脂酸小分子物质的效果;同时以L-精氨酸为目标分析物,初步探讨了Cu O和Ni O两种纳米颗粒直接作为无机基质,对L-精氨酸选择性离子化的可行性。实验中,将待分析物与纳米颗粒悬浮液直接混合于样品板上,自然蒸干溶剂形成结晶状,采用337 nm波长的紫外激光辐照激发,在反射模式的TOF-MS条件下检测分析。结果表明,ZnO纳米颗粒作为一种半导体材料,具有较强的紫外吸收,可直接作为无机基质,能够避免使用传统基质带来的干扰,简化质谱图,尤其在负离子模式下能够提高硬脂酸离子化的峰强度。此外,通过比较Cu O和Ni O纳米颗粒对于L-精氨酸分析检测结果的差异性,初步实现了Cu+对L-精氨酸的选择性检出。

溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析了溶菌酶标准蛋白,在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段,Mascot得分420,鉴定覆盖率为54%。此外,经人工解析发现,肽段IVSDG-DGMNAWVAWR(98→112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰,在激光解吸电离过程中发生脱水反应,脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外,还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明,选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据,有可能发现一些特殊的蛋白质修饰,可增加数据利用度和分析结果的确定性。

高效辅助激光解吸/电离聚合物的新基质α-腈基阿魏酸在飞行时间质谱中的应用研究

以α-腈基阿魏酸(CFA)为基质,利用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)对新合成的聚合物A和B进行分析,获得了聚合物的相对分子量、分子量分布、重复结构单元以及末端基结构等信息。与常用基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、芥子酸(SA)和蒽三酚(DIT)等几乎不能解吸/电离聚合物A和B的结果相比较,CFA展现出优越的基质性能,获得了分辨率和信噪比较高的聚合物质谱图,为聚合物分析提供了丰富的信息,并为该类聚合物合成反应条件的优化和反应机理的推导提供确凿依据。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

综述了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的发展、在糖类化合物结构研究时常选用的基质,以及在不同类型糖化合物分析中的应用。MALDI-TOF-MS在糖类分析中通常采用的是N2激光源,基质多为有机小分子如2,5-二羟基苯甲酸、2,4,5-三羟基苯乙酮、1-羟基异喹啉或2-羟基-5-甲氧基苯甲酸、α-氰基-4-羟基-苯丙烯酸等,基质类型的选择则要取决于糖类的存在形式。糖类化合物如中性糖、酸性糖、硫酸化糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等均可利用适合的基质而进行MALDI-TOF-MS分析。

基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析人乳β-酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组

通过体外模拟新生儿消化道条件,用基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱法（MALDI-TOF/TOF）探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽组。在离子源加速电压为20 k V,激光波长337 nm,激光频率200 Hz,离子延迟提取时间330 ns,质谱信号单次扫描累加2000次条件下,扫描质量范围m/z 500~5000的肽段。结果表明,消化后得到26个肽段,分子量集中在1000~4000 Da。与已知功能的肽段序列进行对比,人乳β-酪蛋白在新生儿体外模型消化后未产生与已知功能的活性肽序列匹配的肽段,但发现9个肽前体,其中含4个血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽前体,2个酪蛋白磷酸肽（CPP）前体,2个抗氧化肽前体,1个免疫活性肽前体,由酶切位点推测分析,肽前体可以继续在蛋白酶作用下转化为生物活性肽。

3-氨基喹啉在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定聚合物中的应用研究

采用3-氨基喹啉(3-AQ)为基质,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对合成的一种广泛应用于生物材料、抗菌等领域的聚合物生物碱进行了测定。结果表明:3-AQ能高效解吸/电离此种类型高分子聚合物,获得了合成目标物的分子量分布、重复结构单元及末端基结构等信息,为目标物的合成反应条件的优化和反应机理的推导提供确凿依据。3-AQ可成为MALDI-TOF-MS分析聚合物基质的新选择。