乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20-47)的单链抗体在转基因烟草根分泌物中的初步表达

为探索利用植物根分泌表达重组蛋白的可行性,构建了含有抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20—47)单链抗体(ScFv)基因的表达载体。该ScFv基因转化烟草后在烟草根部细胞的细胞质和内质网中获得表达。实验结果表明,5’端融合ER导向信号肽的重组ScFv可通过根分泌表达。

含preS2免疫表位乙型肝炎表面抗原DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答

目的 探讨含preS2免疫表位基因质粒DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答。方法 质粒转染COS 7细胞 ,用ELISA法测定瞬时表达产物。质粒经碱裂解法大量提取 ,Sepharose 4FF柱层析纯化后 ,直接肌肉注射免疫NIH小鼠。检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答效果。结果 preS2表位多肽和HBsAg高效表达。免疫小鼠血清中检测到高滴度的抗 HBs和抗 preS2。淋转刺激指数SI和IL 2活性 ,质粒DNA疫苗与单纯主蛋白疫苗免疫对照组比较 ,差异有显著意义。

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA ,采取PCR技术扩增出前表面抗原 (preS)基因片段 ,重组到质粒载体上 ,对该基因进行了全序列测定 [GenBank索取号CpreS HZ :AF 32 5 6 74;preS LZ :AF 32 5 6 75 ]。克隆的HBVpreS基因杭州分离物 (preS HZ)和兰州分离物 (preS LZ)全长 5 2 2个核苷酸 ,编码174个氨基酸。preS HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8] 、北京分离物[9] 、日本分离物[5] 、HBVadw亚型[10 ] 和ayw亚型[11] preS基因的核苷酸序列同源性分别为 96 .7%、96 .2 %、97.3%、88.7%和 84.1% ,氨基酸序列同源性分别为 96 .0 %、94.9%、97.1%、85 .1%和 85 .4% ;preS LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为 96 .4%、96 .2 %、96 .9%、88.7%、83 .7% ,氨基酸序列同源性分别为 94.9%、94.9%、96 .0 %、85 .1%、84.1%。分子进化分析 (DNASTAR ,1999)表明 ,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型。preS LZ与preS HZ之间有两个核苷酸变异 (对应两个氨基酸变异 ) ,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点。在免疫保护区内二者具有较好的保守性 ,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。

哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面S+PreS1融合抗原的理化和生物学性状

研究了哺乳动物细胞(转基因GdSS1-18细胞系)分泌的乙型肝炎(乙肝)病毒表面S+PreS1融合抗原(SS1)纯品的理化及生物学性状,结果表明:经HPLC柱层析呈现一个对称峰,证明HBsAg颗粒所带电荷的均一性;SDS-PAGE出现P24及P27条带,未出现Gp30的条带,凝胶扫描分析其各条带分别各占22 3%、77 7%、0%;West ernblot试验证实,P27和Gp30能与S及S1抗体结合,而P24条带仅能与S抗体结合,表明S、PreS1是特异性条带;N-末端的氨基酸序列与所用目的基因编码的序列相同;乙肝SS1融合抗原在4℃储存较稳定。动物实验结果表明:与单纯含S基因的参比疫苗相比,含SS1融合基因疫苗免疫Balb/c小鼠既产生S抗体,又产生S1抗体,S抗体的ED50滴度与参比疫苗相似,S1抗体产生早于S抗体。

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论 GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的 :分析乙型肝炎病毒 pre S2蛋白在 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法 :采用原核显微注射法将质粒 pc DNA3.1- pre S/ St注射入小鼠受精卵雄原核 ,制备转基因小鼠。PCR法在基因组水平筛选 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠首建者 (founder)及后代 ;免疫组织化学法在蛋白水平检测 pre S2蛋白在这些小鼠中的表达 ;H- E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果 :经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后 ,共出生 15只新生小鼠 ,其中存活 7只 ,经 PCR检测后获得 2只 founder转基因小鼠 ,命名为 C5 7- Tg N (pre S/ St) SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有 pre S 2蛋白表达 ,H- E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这 2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配 ,进行传代培育 ,PCR法筛选阳性转基因小鼠 ,目前已传至 F2 代。 结论 :本研究成功建立了稳定遗传 3′末端缺失的 pre S/ S基因并表达 pre S2蛋白的转基因小鼠 C5 7- Tg N((pre S/ St) SMMU,它将是体内研究 3′末端缺失的 pre S/

恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 。

乙肝表面抗原S_2S基因在蓝藻Synechococcus sp. PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2 S片段从乙肝病毒中扩增得到 ,将其插入到蓝藻热休克表达载体 pEUTMT1中 ,构建成表达重组质粒 pES2ST1。将蓝藻Synechococ cussp .PCC794 2的总染色体与质粒 pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切 ,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒。经转化筛选得到蓝藻Synechococcussp .PCC794 2转化藻株。PCR和Southern杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中。转化藻通过热诱导后 ,Northern blot结果呈阳性 ,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达 ,检测含量约为 0 .78～ 0 .6 4ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的 1.1× 10 - 6 ～ 1.5× 10 - 6 。

血清PreS1、PreS2抗原在乙肝诊断中的价值

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病．可引起肝硬化及肝癌。我国是乙肝大国．平均感染率高达10％以上．以往通常用乙型肝炎病毒标志物（HBV—M1及HBV—DNA的检测结果来明确诊断及指导治疗。近年来研究发现Ⅲ．HBV外膜蛋白抗原PreS1与PreS2的抗原性较强．对乙肝诊断具有一定的临床意义。本组对389例不同HBV标志物模式的标本进行了PreS1及PreS2抗原检测．并将结果进行比较和分析，旨在评价血清PreS1、PreS2抗原在乙肝临床诊断中的价值。

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。

免疫接种后HBV感染者PreS2基因变异的情况

目的:本课题应用PCR和基因测序等技术,观察免疫接种后慢性乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,H B V)感染者的PreS2基因变异情况,进而初步探讨乙型肝炎疫苗免疫失败与P r e S2基因变异之间的相互关系;为进一步探索新的HBV抗病毒基因治疗靶点提供理论基础.方法:收集昆明市延安医院和昆明市第三人民医院免疫接种后慢性HBV感染者的血液标本共47例,从血清标本中提取HBV DNA;用PCR法扩增Pre S2基因片段;扩增后的基因片段进行DNA序列分析.扩增出PCR产物的有35例,上海生工测序最终完成测序的有32例,其中男18例,女14例,年龄19-56岁,平均年龄32.75岁±10.22岁.32份样本的HBV Pre S2基因片段测序后,以Gen Bank数据库中登录号为NC_003977.1的HBV DNA全基因序列为参照,用Chromas软件分析测序图及BLASTN对测序结果进行比对分析后,采用SPSS11.5统计软件进行统计分析.结果:32例标本中Pre S2基因全部出现点突变(100%),其中2例出现缺失突变(6.3%),提示可能存在Ile、Tyr、Phe、Gly、Arg等氨基酸的缺失,32例标本均未发现Pre S2起始密码子ATG的变异,点突变共发生517次,Pre S2基因碱基突变有11种类型:G-A、A-G、T-C、A-T、G-T、C-T、G-C、A-C、C-G、C-A、T-A.11种不同类型的点突变在突变例数率及突变次数率方面均不全相同,其中A-T的突变例数较多,G-A的突变次数较多,差异有统计学意义(P<0.05).Pre S2基因不同部位点突变比较结果显示Pre S2基因前端、中段、末端点突变率不全相同,其中中段(nt45-99),即Pre S2基因的56-110位点突变率较高,前端突变率较低,差异有统计学意义(P<0.05).结论:Pre S2基因变异与免疫失败可能存在相关关系,这将为今后深入研究乙型肝炎疫苗免疫失败的发生机制并用于指导临床实践提供理论基础.同时,进一步确定Pre S2基因变异位点,并针对这些靶点设计相应的基因治疗方法,也可能成为今后乙型肝炎疫苗免疫研究的新方向.

HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBVPrdS2 +S和IFN α融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α并在真核细胞中进行表达。应用重叠延伸剪切技术 (splicingbyoverlappingextension ,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN α ,回收后直接克隆到 pcDNA3.1V5 /HisTOPOTA克隆载体 ,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN α。然后用脂质体法转染VeroE6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定 ,证明连接正确 ;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α的成功构建及在VeroE6细胞中的有效表达 。

HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达. 方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/ Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞. 结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,汪明连接正确;经间接免疫荧光捡测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白. 结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0 细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据.

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株的ＭＳＡ２基因，测定并分析了全基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株ＭＳＡ２基因序列完全相同，全长为７９５ｂｐ，编码２６４个氨基酸，与ＦＣＱ－２７／ＰＮＧ株ＭＳＡ２高度同源。对抗原表位进行多参数综合分析表明，我国虫株除具有国外已确定的抗原表位ＳＴＮＳ、ＤＴＰＴＡＴＥ外，在第５３—７２位氢基酸间可能具有一个新的抗原表位。

昆明地区HBsAg与抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者流行病学调查及PreS/S基因突变特征

目的探讨昆明地区HBsAg与抗-HBs(Anti-HBs)双阳性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者流行病学及PreS/S基因突变特征。方法选择2018年5月—2022年4月于云南大学附属医院住院及门诊定量检测乙肝两对半的438例慢性HBV感染患者为观察对象,将202例HBsAg(+)/抗-HBs(+)患者作为观察组,将236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者作为对照组,对比两组患者临床特征。使用巢式聚合酶链反应扩增出PreS/S基因全长序列,确定基因型并分析PreS/S基因突变特征。结果观察组患者在<10岁及高于80岁人群中的流行率较高,而对照组在20~49岁人群中的流行率较高。与对照组比较,观察组患者年龄、HBsAg<250 IU/mL比例、C型HBV感染及乙肝携带者比例均显著增加(P<0.05)。成功扩增PreS/S并测序成功的观察组样本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;对照组样本中B型基因110例,C型基因65例。B型基因患者中,与对照组比较,观察组N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。C型基因患者中,与对照组比较,观察组MHR、a决定簇及N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。在观察组中,81例B型基因患者中PreS基因缺失突变14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突变19例(37.25%),而在对照组中未发现PreS基因缺失突变。结论HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,HBsAg/抗-HBs双阳性可能与HBsAg突变及PreS基因突变有关。

含preS2免疫表位的HBsAg基因质粒的构建及表达

目的 :应用表位设计构建高效表达乙型肝炎表面抗原含preS2免疫表位基因的真核表达质粒。方法 :PCR法从慢性乙型肝炎患者血清中扩增和分离preS2 12 0 - 146表位和S基因片段 ,将两者融合并置于载体pcDNA3 1的巨细胞病 (CMV)启动子作用之下 ,构建真核表达质粒pcDNA -S2S。序列分析和脂质体转染COS - 7细胞瞬时表达鉴定。结果 :序列测定结果表明插入序列与乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列 (adr亚型 )一致。COS - 7细胞瞬时表达鉴定实验中 ,ELISA检测到preS2 -Ag和HBsAg的OD450 分别为 0 4 6 9和 0 4 2 6。结论 :应用表位设计成功地构建了含preS2免疫表位基因的重组质粒pcDNA -S2S所构建质粒能高效表达和分泌目的的蛋白。

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。

乙型肝炎病毒PreS_2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。