B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70的制备及其抗瘤效应

背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,SmIg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是自体成分,分子量小,免疫原性较弱。人热休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)是一类重要的抗原提呈分子,能有效加强抗原肽的免疫原性。本研究通过制备慢性B型淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphatic leukemia,B-CLL)患者瘤细胞膜表面独特型单链抗体(Idiotypic determinant single-chain antibody,Id-ScFv)和Hsp70两种蛋白,在体外研究两者联合抗瘤作用并初步探讨其机制。方法:分别在大肠杆菌中表达Id-ScFv和Hsp70两种蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)及ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)检测鉴定后,分别用金属螯合层析和离子交换层析纯化并在体外将这两种蛋白结合成复合物(Hsp70-Id)。用MTT法及检测Id-ScFv组、人Hsp70组及Hsp70-Id组刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖作用,以ELISA法检测各组培养上清中IL-12和TNF-α水平,并用流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化。用活细胞计数法检测各组被激活的PBMC对慢性B细胞白血病细胞株Daudi、慢性髓性白血病细胞株K562和肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果:经SDS-PAGE电泳分析纯化后表达产物的分子量大约为30ku(Id-ScFv蛋白)和70ku(Hsp70蛋白),分别与其理论预期值相符。PBMC的增殖作用、培养上清中IL-12和TNF-琢水平,Hsp70-Id组明显强于Id-ScFv组和人Hsp70组(P<0.05),而Id-ScFv组和人Hsp70组明显强于阴性对照组(P<0.05)。流式细胞术检测显示在Hsp70-Id组、Id-ScFv组和人Hsp70组PBMC中CD8+T细胞亚群的百分率均有增加,其中Hsp70-Id组最明显。在Id-ScFv组和Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用较K562、HepG2细胞强(P<0.05),且Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用明显强于Id-ScFv组(P<0.001)。结论:成功获取B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70两种纯化蛋白;Hsp70-Id在体外可增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖、活化CD8+T细胞并诱导具有抗肿瘤作用的Th1型细胞因子的分泌有关。