肺炎链球菌表面粘附素A蛋白抗原表位的预测筛选及确定

【目的】确定肺炎链球菌表面粘附素A(Psa A)蛋白抗原的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞表位。【方法】通过生物信息学方法预测肺炎链球菌Psa A蛋白分子小鼠B细胞线性表位、MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)及MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)并人工合成相应肽段;克隆重组质粒BL21/p ET/Psa A并得到纯化的r Psa A蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组和对照组小鼠的血清分别与人工合成的候选B细胞表位肽段进行间接ELISA检测,筛选B细胞表位;分离小鼠脾及淋巴结细胞并分别与人工合成的T细胞候选表位肽段体外共培养,取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ的量进行初步筛选。用初筛到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式检测,确定Psa A蛋白分子T细胞表位。【结果】分析Psa A蛋白分子的B细胞表位及MHC-Ⅰ结合肽、MHC-Ⅱ结合肽;得到候选B细胞表位肽10条,MHC-Ⅰ结合肽21条,MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了r Psa A蛋白并成功免疫了小鼠。间接ELISA结果显示:肽段PB2、PB6,PB7与r Psa A免疫小鼠的血清发生反应,其OD450nm读数比相应的阴性对照小鼠显著升高;双夹心ELISA结果初步提示:肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高。细胞流式结果进一步确定:经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较对照小鼠细胞显著升高;经肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较对照小鼠细胞显著升高。【结论】确定了肺炎链球菌Psa A蛋白分子的3个B细胞线性表位;2个CD4 T细胞表位;3个CD8 T细胞表位。