衰变加速因子结构及其功能研究进展

衰变加速因子为体内补体调控蛋白家族中的一种重要的同源限制因子,它对于防止同源补体对自身组织细胞的溶破有重要意义,并参与机体多种病理生理过程,如肿瘤免疫、生殖免疫、微生物感染等。本文综述了DAF的结构及其功能研究进展,并指出了其在免疫学,尤其在异种器官移植方面的应用前景及存在的问题。

人衰变加速因子在酵母细胞表面的呈现

目的为获得能在酵母表面正确折叠的人衰变加速因子。方法通过 PCR技术从 DAF- p Bluescript M13- (Amp+ )质粒扩增出全长的 DAF c DNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体 p YD1,构建 DAF- p YD1重组质粒 ,转化酵母细胞 ,流式细胞仪检测所呈现的 DAF。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有 DAF分子的表达 ,并且此表面呈现的 DAF与针对DAF不同表位的 3株单抗均能结合。结论酵母表面呈现的 DAF保持了天然 DAF分子的构象 ,为进一步构建

异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人DAF重组基因载体的构建

PCR插入法将人 ICAM-2启动子、人 DAF-intron1和 DAFc DNA克隆到 p GEM-7zf质粒中 ,进行序列测定及分析 .成功构建异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人 DAF重组基因 .提供了人 DAF重组基因用于转基因动物的研究 .

人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人 DAF基因在小鼠体内遗传与表达的规律 ,从质粒 p SFFV- DAF分离出一段包含人 DAF基因的 DNA片段 .采用受精卵显微注射法建立转人 DAF基因小鼠 .提取出生小鼠的染色体 DNA,经 Dot- blot与 Southern- blot杂交相结合确定首建转基因小鼠 ,并经Dot- blot杂交研究人 DAF基因在转基因小鼠体内的遗传特征 ,Northern杂交确定其表达情况 .小鼠受精卵经基因导入后 ,共生出 2 4只小鼠 ,其中 4只被确定为首建转基因小鼠 ,整合率为 1 5% .在首建转基因小鼠两两交配生出的 F1代小鼠中分别有 70 %和 75%继续携带人DAF基因 .首建转基因小鼠中有 1只小鼠在 RNA水平表达了人 DAF基因 .可见 ,人 DAF基因整合入小鼠基因组中 ,并能够稳定遗传及表达 .

杆状病毒表面展示DAF蛋白抵抗血清补体系统灭活的研究

拟在杆状病毒表面展示补体调节蛋白,即衰亡加速因子(CD55;decay-accelerating factor,DAF),以此来评价其抵抗补体灭活的功效。以pFastBac DUAL质粒为骨架,在p10启动子下游插入GP64 SP-DAF-GP64 TM-GP64 CTD表达元件,同时在pPh启动子下游插入CMV-EGFP表达元件,获得的质粒命名为pBacSC-DAF-CE;同时作为对照,构建pBacSC-CE。将构建好的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选、脂质体介导转染Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSC-DAF-CE和BacSC-CE。结果表明,经PCR鉴定以及测序,成功构建了重组质粒pBacSC-DAF-CE和pBacSC-CE;Western blot和激光共聚焦结果表明,DAF蛋白在BacSC-DAF-CE感染的Sf-9细胞中获得了表达,并且成功展示在了Sf9细胞膜上;血清补体敏感性试验结果表明,随着血清浓度的增加,重组病毒BacSC-DAF-CE和BacSC-CE转导HUVEC细胞的效率逐渐降低;经统计分析,不管血清浓度是20%、40%、60%还是80%,BacSC-DAF-CE组与BacSC-CE组相比,eGFP+%的表达效率明显增高(P<0.05)。成功构建了表面展示DAF蛋白的重组杆状病毒系统,该系统能有效地抵抗小鼠血清补体系统的灭活,研究结果为下一步验证其体内转导效率奠定了工作基础,同时为抗肿瘤或其他恶性疾病的基因治疗提供了良好的基因传递平台。