猪导入人类促衰变因子(hDAF)的整合与表达

将人类促衰变因子 ( human decay accelerating factor,h DAF)基因显微注入 51 7枚猪的受精卵 ,移植到2 6头受体母猪的输卵管内。 2 1头怀孕 ,产仔 93头。产仔后 ,取仔猪的耳或尾组织 ,提取总 DNA。以 5′-TGGCGAGAAGGACTCAGTGATCT-3′和 5′-TGAACTGTTGGTGGGACCTTGGA-3′为引物 ,进行 PCR扩增 ,有 1 8头显示阳性。转基因效率为 3 .5%( 1 8/ 51 7)。对存活的 1 4头转基因猪用免疫荧光法进行检测 ,并采用 MPIAS-50 0多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析 ,其中有 7头的动脉肌肉层中显现有荧光 ,其平均灰度在 1 2 7.3～ 1 70 .

促衰变因子在三阴性乳腺癌中的表达及其对预后的影响

目的:探讨长度促衰变因子(DAF,CD55)在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及与预后的关系。方法:用免疫组化S-P法检测100例TNBC及50例TNBC旁乳腺组织中CD55的表达;结合临床病理和随访资料,建立Cox模型进行预后分析。结果:CD55在TNBC中的表达率为56.0%,在癌旁乳腺中的表达率为8.0%,两者之间差异有统计学意义(x2=32.0,P<0.05)。CD55的表达与肿瘤大小、临床分期及腋下淋巴结转移均具有显著相关(x2=7.404,x2=8.688,x2=4.802;P<0.05),而与年龄和组织学分级无显著相关。多因素分析显示,年龄、临床分期、CD55及腋淋巴结转移情况4项指标是影响患者DFS的独立危险因素;临床分期及腋淋巴结转移情况两项指标是影响患者OS的独立危险因素。结论:CD55的高表达可能参与了TNBC的发生、发展过程,并与预后有相关性,提示CD55的表达可能成为判断TNBC浸润进展及预后的指标之一。

促衰变因子(DAF)研究进展

八十年代中期,随着环孢素A的发观,同种器官移植取得了飞速发展.但随之而来的问题是供体器官的严重不足,使得无数患者在等待中死亡.因此,人们开始对异种器官移植(Xenograft)有了浓厚的兴趣.

促衰变因子的研究进展

近年来，国外对促衰变因子（DAF）的研究非常活跃。本文综述了DAF的分布及形成．生物化学、分子生物学表达调控及临床应用。相信不久的将来，在人类器官的移植中．DAF将发挥巨大的作用。

^(220)Rn延迟符合测量中偶然符合及存活因子和衰变因子的确定

介绍了一种220Rn延迟符合测量中确定偶然符合的方法及计算公式,通过对符合输出数据引入泊松分布达到准确修正偶然符合的目的。利用实验装置对低活度220Rn源进行测量,对同一测量数据进行偶然符合修正求解得到真符合时,该方法与Giffin方法两者相对偏差均在5%以内;通过该方法求源活度,与RAD7连续测氡仪进行了比对,其测量结果与RAD7测量值相对偏差均在14%以内。同时提出了通过实际测量比较的方法求存活因子和衰变因子的计算方案,避免了现有理论计算公式的误差。

人衰变加速因子的二级结构与B细胞表位预测

目的 :分析预测人衰变加速因子的二级结构特征及B细胞表位。方法 :比较Chou&Fasman经典方案和基于多重序列比较的PHDsec二级结构预测方案的预测准确率 ,应用较优方案对DAF的二级结构进行预测分析 ;运用Hopp&Woods的亲水性方案及PHDacc可及性方案预测DAF的亲水性和可及性 ,结合DAF的二级结构特征 ,分析预测DAF的B细胞表位。结果 :PHDsec方案对SCR的预测准确率明显高于Chou&Fasman方案 ,DAF的SCR1 4中无α螺旋 ,仅包含 β折叠及袢 ;推测最可能的抗原表位位于Pro73 Val79、Arg130 Leu139及Glu15 6 Cys16 3;SCR1、SCR2与SCR3、SCR4在亲水性及二级结构分布方面具有较大差异。结论

人衰变加速因子在酵母细胞表面的呈现

目的为获得能在酵母表面正确折叠的人衰变加速因子。方法通过 PCR技术从 DAF- p Bluescript M13- (Amp+ )质粒扩增出全长的 DAF c DNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体 p YD1,构建 DAF- p YD1重组质粒 ,转化酵母细胞 ,流式细胞仪检测所呈现的 DAF。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有 DAF分子的表达 ,并且此表面呈现的 DAF与针对DAF不同表位的 3株单抗均能结合。结论酵母表面呈现的 DAF保持了天然 DAF分子的构象 ,为进一步构建

心肺转流不同氧分压对红细胞衰变加速因子的影响

目的 探讨心肺转流（CPB）中不同动脉氧分压（PaO2）对红细胞衰变加速因子（DAF或CD55）的影响.方法 40例心脏病患者随机均分为四组：紫绀型先天性心脏病高氧分压组（A组）及正常氧分压组（B组）,非紫绀型心脏病高氧分压组（C组）及正常氧分压组（D组）.CPB中,A、C组PaO2控制在300～500 mm Hg,B、D组PaO2控制在100～250 mm Hg.于CPB前（T1）、CPB15 min（T2）、主动脉开放15 min（T3）、术后24 h（T4）采集动脉血,用小鼠抗人CD55 FITC荧光单克隆抗体直接标记,流式细胞仪检测红细胞CD55活性及数量.结果 A组T2、T3时的红细胞CD55活性明显高于T1时（P〈0.05）.但红细胞CD55数量差异无统计学意义.B、C、D三组各时点红细胞CD55活性及数量差异无统计学意义.结论 CPB中高氧分压可使紫绀型心脏病患者的红细胞CD55活性明显增强,缺氧红细胞可能存在再氧合损伤;控制氧分压对红细胞免疫功能有一定的保护作用.

衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL-2中的作用

目的研究衰变加速因子对 CD3阳性与阴性 Jurkat细胞的增殖效应及对 IL- 2分泌的影响。方法应用 MTT比色实验观察交联 DAF单抗 DG3与固相化抗 CD3联合作用对 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞增殖效应 ;IL - 2依赖 CTL L3H- Td R掺入实验检测 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞 IL - 2的分泌 ;细胞 EL ISA检测 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞IL - 2 R的表达。结果交联 DG3可协助促进固相化抗 CD3对 CD3阳性 Jurkat细胞的增殖效应和 IL - 2分泌 ,并可引起 IL - 2 Rα链表达增加 ,此作用可被 Src家族酪氨酸激酶抑制剂 PP2所抑制 ,而对 CD3阴性 Jurkat细胞无此作用。结论衰变加速因子可协同促进固相化抗 CD3对 CD3阳性 Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL- 2分泌及 IL- 2 R表达增加。

衰变加速因子结构及其功能研究进展

衰变加速因子为体内补体调控蛋白家族中的一种重要的同源限制因子,它对于防止同源补体对自身组织细胞的溶破有重要意义,并参与机体多种病理生理过程,如肿瘤免疫、生殖免疫、微生物感染等。本文综述了DAF的结构及其功能研究进展,并指出了其在免疫学,尤其在异种器官移植方面的应用前景及存在的问题。

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的:构建人补体衰变加速因子(DAF)真核表达载体pSecTag2/HygroBDAF,并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体,转染小鼠NIH/3T3成纤维细胞。方法:应用PCR方法,从DAFpGEMTEasyVector克隆相关的DNA序列,插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,构建pSecTag2/HygroBDAF真核表达质粒,并进行酶切鉴定及序列测定;利用壳聚糖包裹质粒,转染小鼠NIH/3T3细胞,并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果:DAF基因大小为1049bp,与基因序列数据库中记载的人DAFcDNA序列结果完全一致;利用壳聚糖DAF纳米微粒转染NIH/3T3细胞24h后,免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论:成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH/3T3细胞。

衰变加速因子在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的检测衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF,CD55)在非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)中的表达,分析其表达与临床分期、化疗用药及预后的关系。方法免疫组化法检测8例NSCLC癌旁组织和36例NSCLC手术标本中DAF的蛋白表达,分析临床资料。结果免疫组化结果显示36例NSCLC标本中,共有18例(50.0%)表达DAF,其中18例肺鳞癌中有15例(83.3%)表达,而16例肺腺癌中有3例(18.8%)表达,两者有显著差异(P<0.05);不同的病理分期的DAF免疫组化平均积分光密度表达有显著性差异(P<0.05);DAF的表达与无病生存期无相关关系(P>0.05)。结论NSCLC中有DAF的表达,尤其是肺鳞癌;提示在NSCLC抗体治疗中应同时阻断DAF的免疫抑制效应。

异种移植转基因用含杂合增强子UI的人衰变加速因子重组基因的构建

目的:构建含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体,应用于转基因动物克服异种器官移植排斥反应的研究。方法:ClaI/EcoRI双酶切质粒pXMT2得到UI增强子插入片段(0.3Kb),将其插入pBlue-scriptIISK+克隆载体的相应酶切位点之间;XbaI/BamHI双酶切质粒pGEM-7zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段(3.7Kb),将其也插入到pBluescriptIISK+克隆载体的相应酶切位点之间。随后转化细菌,阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。设计引物行PCR特异扩增检验。结果:特异性3组酶切重组载体均产生了符合要求的相应条带;PCR扩增出特异的330bp及321bp的片断,符合设计要求。结论:含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体构建成功。

人衰变加速因子在CHO细胞的表达及其衰变加速活性研究

目的 获得稳定表达人衰变加速因子 (humandecay acceleratingactivity ,hDAF)的中国仓鼠卵巢 (Chineseham sterovary ,CHO)细胞系 ,观察在补体活化情况下 ,hDAF对异种细胞的保护作用。方法 构建真核表达载体DAF pcDNA3 .1,用脂质体转染法将其导入CHO细胞 ,有限稀释法筛选稳定表达hDAF的单细胞克隆 ,流式细胞仪检测hDAF的表达 ,C3沉积实验和51 Cr释放法测定其促补体衰变活性。结果 成功构建了真核表达载体DAF pcDNA3 .1,并获得了表达hDAF的单细胞克隆 ,表达hDAF的CHO能减少补体C3的沉积 ,减弱补体的杀伤作用。结论 获得在细胞膜上稳定表达具功能活性的hDAF的CHO克隆 ,为进一步研究其结构与功能的关系准备了条件。

人红细胞膜衰变加速因子的分离纯化及其生物学活性鉴定

目的 获得纯化并具有生物学活性的人红细胞膜衰变加速因子。方法 经胰蛋白酶消化、正丁醇抽提及DE32和Sepharose 6B色谱分离等步骤从人红细胞膜影中分离纯化人红细胞膜衰变加速因子 (DAF)。以SDS PAGE及免疫印迹实验检测纯度及抗原特异性 ,以C3转化酶体外组装实验及促衰变活性实验检测其补体抑制活性。结果 4 0 0mL人全血最终可得纯化DAF约 370 μg ,回收率达 10 .4 % ;比活性为每毫克 2 .2 4× 10 5units;纯化产物在SDS PAGE表现为 70 0 0 0u的单一蛋白条带 ,在免疫印迹实验中可与抗人DAF单抗特异性结合。在生物学活性实验中 ,纯化产物既可促进C3转化酶衰变 ,也可抑制C3转化酶形成。

衰变加速因子在宫颈癌中的表达及其生物学意义

目的探讨衰变加速因子(DAF)在宫颈癌中的表达及其生物学意义。方法以宫颈癌细胞系ME180、宫颈癌组织和癌旁正常组织为材料,采用real-time PCR和western blotting检测DAF基因的mRNA和蛋白质表达水平;用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入量(3H-thymidine incorporation,3H-TdR)检查宫颈癌细胞的增殖,用Transwell小室法评估宫颈癌细胞的迁移能力。结果DAF的表达在宫颈癌组织中明显高于其配对的癌旁正常组织,抑制DAF基因的表达能明显降低ME180细胞的增殖、迁移能力。结论DAF在宫颈癌细胞中的高表达可能是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制,对宫颈癌的发生发展有重要的生物学意义。

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的:构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法:将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果:成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论:真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。

人补体衰变加速因子、补体膜辅助调节蛋白及CD59真核表达载体构建及序列分析

目的:构建人补体衰变加速因子(Decayacceleratingfactor,DAF)、补体膜辅助调节蛋白(membranecofactorprotein,MCP)、CD59的真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-MCP、pSecTag2/HygroB-CD59。方法:应用PCR方法,从DAF-pGEM-TEasyVector、MCP-pGEM-TEasyVector和CD59-pGEM-TEasyVector分别克隆所需的DNA片段,经限制性内切酶BglandXhol消化后,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,分别构建人DAF、MCP、CD59真核表达质粒,并进行酶切鉴定及DNA序列测定分析。结果:DAF基因大小为1049bp,MCP基因大小为1065bp,CD59基因大小为312bp,与genbank中记载的人DAF、MCP和CD59cDNA序列结果基本相同。结论:成功构建DAF、MCP和CD59真核表达质粒,为今后进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。

衰变加速因子在神经病理性疼痛中的作用

目的观察衰变加速因子(DAF)在2种外周神经损伤模型大鼠脊髓背角的表达情况,旨在探索它在神经病理性疼痛(NPP)发病机制中的作用。方法将60只健康雄性SD大鼠分为假手术组、CCI组和SNI组3组,按分组制作模型,分别于术前及术后1,3,7 d,用热刺激和机械刺激法测定大鼠的痛阈值变化,评估其可靠性后,于术后7 d处死大鼠,取L4—6段脊髓背角,用Western-blot和免疫组化两种技术测定其DAF蛋白含量。结果 CCI组和SNI组大鼠于术后1,3,7 d痛阈值降低,与假手术组比较有显著性差异,表明模型制作成功。Western-blot检测显示,3组模型大鼠脊髓背角DAF表达发生不同程度降低,CCI组和SNI组与假手术组相比有显著性差异。免疫组化染色显示:CCI组、SNI组大鼠脊髓背角DAF阳性细胞较假手术组显著减少。结论 NPP大鼠脊髓背角CD55蛋白表达下降,可能是此处发生补体级联反应的重要原因,CD55在NPP的形成中发挥作用。

人衰变加速因子与异种器官移植

目前全世界每年有数十万的患者因行器官移植手术而得以存活，然而移植技术的日趋成熟使得器官移植形成了供不应求的局面。供体器官的短缺使人们把目光投向了异种移植，而异种移植带来的第一个问题即是排斥反应特别是超急性排斥反应（hyperactue rejection，HAR）。近来人们利用抗体去除、补体去除或抑制补体激活在一定程度上阻止了HAR的发生，