拟南芥叶片和角果特异性启动子的筛选与分析

通过生物信息学方法和Genevestigator程序,从拟南芥基因组中筛选了1个叶片特异性表达基因ACD6(at4g14400)和2个角果特异性表达基因AT2FP2(at5g57520)、at1g56100,并通过实时定量PCR分析它们在拟南芥不同组织中的表达模式。从TAIR网站获得各基因的上游序列,利用Plant CARE和Bio Prospector预测各基因的启动子序列,命名为Pat4g14400、Pat5g57520和Pat1g56100。构建启动子驱动报告基因gus的植物表达载体,转化拟南芥。转基因拟南芥GUS染色后发现:ACD6主要在叶片中表达,Pat4g14400为叶片特异性启动子;AT2FP2和at1g56100在角果中的表达量比其他组织高数倍,Pat1g56100和Pat5g57520具有角果特异性。

以器官和发育特异性抗病双基因转化油菜

菌核病是我国油菜主产区的主要病害 ,系由核盘菌 (Sclerotiniasclerotiorum)的子囊孢子在晚春直接侵染开花植株衰老的叶片 ,或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后再产生菌丝侵入叶片和植株本体。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成成分 ,几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素 ,草酸氧化酶能够分解草酸 ,缓解核盘菌在油菜体内的毒性。我们将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子PSAG12 嵌合在一起构建成表达载体 ,使两外源抗病基因仅在转基因油菜的衰老叶片中表达 ,在发挥抗病作用的同时最大限度地节约了植物的能量消耗。本实验采用inplanta的转化方法 ,转化效率在 0 1%左右 ,每个转基因植株的插入位点为 1- 3个拷贝。对T1代转基因植株的RT PCR分析表明 ,两个外源抗病基因在衰老叶片中的表达强于幼嫩叶片。转基因植株叶片尤其是衰老叶片对核盘菌的抗性及对草酸毒素的耐性均得到了增强。从转基因植株上飘落的花瓣也表现出对核盘菌抗性的提高。抗病双基因在叶片和花瓣发育的特定时期表达不仅提高了油菜对核盘菌侵染的针对性 ,还可能减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱。对转基因植株后代的农艺学和生理学研究正在进行之中。

番茄SlPP2C67启动子克隆及表达分析

番茄(Solanum lycopersicum)PP2C67基因(SlPP2C67)是番茄蛋白磷酸酶2C基因家族的重要成员。本研究以‘Micro-Tom’番茄为材料,采用PCR方法克隆SlPP2C671657 bp启动子序列。启动子顺式作用元件分析表明该启动子除含有CAAT-box与TATA-box等基本调控元件外,还包含多个组织特异表达元件、光响应元件和激素响应元件。用克隆的启动子同向置换pCAMBIA1300-GN载体上的CaMv35S启动子来构建重组表达载体,然后转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行功能验证。GUS组织化学染色结果表明,SlPP2C67启动子驱动GUS基因在拟南芥叶片特异性表达。实时定量PCR结果表明SlPP2C67基因主要在番茄叶片表达,该结果与SlPP2C67启动子驱动的GUS基因在拟南芥中的表达结果一致。本研究为后续开展SlPP2C67基因的功能研究和番茄遗传改良提供理论依据。

农杆菌介导PSAG12-IPT基因转化辣椒的研究

异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferasas,IPT),也称作细胞分裂素合成酶,是植物中细胞分裂素合成的限速酶。IPT在转基因植株中超表达后,会使叶片中的细胞分裂素含量增加,从而延缓叶片衰老。但过高对植物的生长和育性都是有害的。如果将衰老特异性启动子(PSAG)与IPT基因融合,在它的驱动下表达,只有在叶片衰老时才表达合成分裂素,既能延缓衰老又不影响植物的生长发育。以p CAMBIA1301-PMI表达载体为基础载体,用衰老特异性启动子驱动目的基因IPT,用辣椒Flamingobill外植体作受体,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,并利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗衰老检测。结果表明,共获得82株抗性植株,PCR检测的阳性率约为50%。而在对T1代的PCR检测表明该基因能稳定遗传给下一代。这些经转化的植株具有叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象,花的衰老也有所延缓。T1的株高和侧芽萌发与对照相比无明显差异。