pH对衰老相关β-半乳糖苷酶染色的影响

目的观察正常老化及应激诱导老化（stress—inducedprematuresenescence，SIPS）的小鼠成纤维细胞在不同pH值条件下，衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence—associatedp—galactosidase，SA—β-Gal）染色效果的变化规律。方法取新生1～3dC57BL／6小鼠背部皮肤成纤维细胞进行传代培养，UVB照射应激诱导老化细胞，以不同代次的细胞和应激诱导老化细胞为实验对象，进行衰老相关蛋白检测，并在不同pH条件下进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色，对其着色情况进行观察和分析。结果在P1代细胞、P6代细胞、应激诱导老化细胞和P12代细胞中，p53／p21蛋白表达依次增多；正常P1代细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色阴性，其余细胞组随着pH值的由低到高（6．0～8．0），着色情况均呈现由强到弱的变化趋势，P6细胞、SIPS细胞、P12细胞分别在pH7．0、7．5和8．0时阳性染色消失。结论随着细胞衰老程度的增加，衰老相关p一半乳糖苷酶染色将在较高pH时才会呈现假阴性，提示染色时安全pH范围应根据细胞代次而定。

小鼠造血干细胞体外衰老模型的构建及其相关生物学

目的建立造血干细胞(HSCs)体外衰老模型,探讨其衰老的相关生物学调控机制,为寻找延缓HSC衰老方法奠定基础。方法用免疫磁性分选法分离、纯化小鼠Sca-1+HSCs,用流式细胞术鉴定分选细胞纯度,免疫荧光检测分选细胞Sca-1+表达。用三丁基过氧化氢(t-BHP)100μmol/L诱导Sca-1+HSCs 6h,建立HSCs衰老体外模型。采用造血祖细胞集落培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察衰老HSCs的生物学特点。DNA印迹法(Southern blotting)与TRAP-PCR SYBR Green染色法检测HSCs端粒长度和端粒酶活性。RT-PCR法检测衰老相关基因p16Ink4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1 mRNA的表达水平。结果免疫磁性分选法分离、纯化的Sca-1+HSCs纯度可达(87.33±1.25)%。100μmol/L的t-BHP作用Sca-1+HSCs 6h,其体外培养形成造血祖细胞集落能力,自我更新及多向分化潜能显著低于对照组,处于G1期细胞比例增加,SA-β-gal染色阳性细胞数增加。衰老Sca-1+HSCs的端粒缩短,端粒酶活性下降,p16Ink4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA的表达水平明显增高。结论用t-BHP能建立Sca-1+HSCs体外细胞衰老模型,提示p16Ink4a-Rb通路和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1通路在t-BHP诱导Sca-1+HSCs衰老过程中发挥重要作用。

人参皂苷Rg_1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老。流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变。结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为20μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化。结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征。

造血干细胞衰老模型的建立及其评价

造血干细胞衰老模型的建立是研究造血干细胞衰老机理与延缓其衰老的重要途径,目前可通过体内和体外两种途径实现。体内衰老模型可通过供体造血干细胞在受体内连续性移植建立,体外衰老模型可通过白消安、三丁基过氧化氢等致衰老药物和电离辐射等方法建立。造血干细胞衰老模型建立后,可通过其自我更新和多向分化能力检测、细胞周期分析、β-半乳糖苷酶染色等方法检测和评价造血干细胞的衰老变化,并应用Southern bloting,Western bloting,RT-PCR等方法检测造血干细胞衰老相关基因和蛋白变化。本文就造血干细胞衰老模型的建立以及评价方法综述如下。

藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老研究

目的:研究藻红蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导衰老作用。方法:采用MTT法检测藻红蛋白对MCF-7细胞的生长抑制作用,采用倒置显微镜观察形态学变化,酸性β-半乳糖苷酶染色法和衰老相关异染色质聚集检测藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老作用。结果:MTT法结果显示,藻红蛋白对体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用,IC50为134.87μg/mL。结果发现藻红蛋白作用72h后,细胞呈现变大变扁平,细胞内形成空泡、颗粒增多等明显衰老形态。在倒置显微镜下观察,酸性β-半乳糖苷酶染色呈阳性;在荧光显微镜下观察,DAPI染色出现衰老相关异染色质聚集现象。结论:藻红蛋白可通过诱导MCF-7细胞衰老达到抗肿瘤作用。