苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

赣南柑橘产区衰退病毒外壳蛋白基因初步分析

【目的】对江西赣南柑橘果园感染衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）样品的外壳蛋白（CP）基因进行克隆及序列遗传信息分析,为利用弱毒株交叉保护法预防该地区CTV的蔓延奠定基础。【方法】运用RT-PCR扩增样品的CP基因并测序,应用软件检测CP序列基因重组,分析碱基含量,再将所测序列与10个外国CTV分离株计算核苷酸遗传距离,比对序列同源性及构建系统发育树。【结果】214份柑橘样品中有78份感染了CTV,发病率为36.4%。78个样品中仅有一个存在基因重组现象;78个CTV分离株CP基因全长序列均为672 bp,无碱基缺失、插入等现象,CP基因平均GC含量为52.8%,AT（U）为47.2%;所有样品核苷酸遗传距离在0~0.072,与10个已知CTV分离株CP基因核苷酸遗传距离在0~0.106。78个样品的CP基因核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分别为89.1%~100.0%和92.3%~100.0%,与10株已知CTV分离株的同源性分别为76.5%~98.9%和73.6%~99.5%。系统进化分析结果表明,78个分离样品与10株已知CTV分离株可聚为四大类群,第Ⅰ类群包含49个分离样品和7个症状不同的已知CTV分离株（6个强毒型和1个弱毒型）;第Ⅱ类群包含21个样品,国外强毒株系Qaha和引发茎陷点、速衰症状的Mexico-ctv株系聚于此类群;第Ⅲ类群仅由采自瑞金的CRJ14组成;第Ⅳ类群包括一个国外强毒株系HA16-5和采自江口、宁都的样品。【结论】赣南柑橘产区CTV分离株的CP基因保守性较高,序列存在一定程度的变异;各分离株间亲缘性较高但关系复杂,大部分样品与强毒型和茎陷点型分离株相关。

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系 (PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白 (CP)基因 ,并分别插入 pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的基因转化方法 ,将可翻译和不可翻译的PVYN CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中 ,得到抗卡那霉素的再生植株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明 ,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的 95 %和 98%。攻毒实验表明 ,两种类型的转基因烟草对PVYN 的抗病性具有相似性 ,其表现型为 :免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示 ,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明 ,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达 ,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明 ,在表达不可翻译PVYN CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白 ,而在导入可翻译的PVYN CP基因的植株内检测到了CP蛋白 ,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明 ,表达可翻译与不可翻译PVYN CP基因的转基因烟草对PVYN 的抗病性均为RNA介导的抗病性。

转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性

西瓜是夏季的重要水果 ,病毒病是影响其品质和产量的重要原因之一。植物基因工程的发展为抗病育种提供了新途径。利用外壳蛋白 (coatprotein)基因转化高等植物 ,赋予转基因植物以相应抗病性的成功例子已很多。本文报道WMV - 2CP基因在转基因西瓜植株中的遗传、分离、表达以及转基因植株对病毒病的抗性实验结果。通过自交结合PCR检测 ,发现WMV - 2CP基因在自交子一代的分离符合孟德尔 3∶1的分离比。经过连续 4代的选择鉴定 ,已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得 8个转基因纯合株系 ,性状表现整齐一致。Westernblot结果表明 ,R4 T7-1、R4 T11-3以及R4 T32 -73个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV - 2感染后的病毒抗性实验表明 ,与未转基因对照相比 ,转基因株系可以推迟发病时间 ,减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4 T32 -7表现出对WMV - 2的高度抗性 。

黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较

对我国分离的经生物学和血清学鉴定为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ和Ⅱ的各一分离物（ＧＢ、ＸＢ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因进行了序列分析和比较。以提纯病毒ＲＮＡ为模板，进行逆转录及ＰＣＲ扩增，并通过常规基因克隆方法得到插入ＣＰ基因片段的重组克隆。对插入ＧＢ和ＸＢ两个分离物ＣＰ基因片段的重组克隆进行全序列测定，结果表明重组克隆序列长分别为７７７ｂｐ和７９２ｂｐ，均只含一个开放读框（ＯＲＦ），长度为６５７ｎｔ，可编码２１８个氨基酸；两个分离物的ＣＰ基因核苷酸序列同源率为７７５％，氨基酸序列同源率为８２６％。与我国已报道的７个ＣＭＶ分离物的ＣＰ基因序列比较，分离物ＧＢ的同源率为９１３％～９７３％，分离物ＸＢ的同源率为７６６％～７８４％。与国际上已报道部分ＣＭＶ株系的ＣＰ基因序列相比较，分离物ＧＢ与亚组Ⅰ株系有更密切的亲缘关系，而分离物ＸＢ则与亚组Ⅱ株系的亲缘关系更密切。

大蒜E病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

设计特异性引物PCR扩增了余杭大蒜病样中的大蒜E病毒 (GarV E)的全长CP基因 ,构建原核表达载体并在大肠杆菌中过量表达 ,纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。Westernblot检测结果表明 ,抗血清与GarV E的CP起强的特异性反应。 7个大蒜样品中 ,内蒙古赤峰市、宁夏银川和甘肃天水等 4个样品受到GarV E的侵染。试验也证明了田间GarV E编码的CP分子量为 35kD ,不同于已报道的其他葱X病毒属成员的 2

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系 (PVYN)核苷酸序列 ,克隆了PVYN外壳蛋白 (CP)基因 ,通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)LBA4 4 0 4介导的方法 ,转化烟草NC89,获得了 38株PCR呈阳性的转基因植株 .攻毒试验发现 ,转基因植株对PVYN的抗性水平存在着差异 ,其中有 4株表现为高度抗病性 .Southernblot表明 ,PVYN CP基因已经整合到烟草染色体中 ,转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关 .Northernblot表明 ,PVYN CP基因在RNA水平上得到了表达 ,而且PVYNCPRNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关 .Westernblot表明 ,高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质 ,而抗病和感病植株都检测到了PVYN CP蛋白 ,且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异 .实验结果表明 ,表达PVYN CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默 ,即抗病性可能是RNA介导的 .图 7表 1参

土传花叶病毒外壳蛋白基因导入小麦的研究

利用基因枪技术 ,将小麦土传花叶病毒外壳蛋白基因CWMV CP1和筛选基因bar导入扬麦 15 8,获得14 5株抗Bialaphos再生植株 ;PCR Southern分析 ,其中 2 1株为阳性植株 ,转化率达到 0 .99% ;T1代植株的PCR Southern、单酶切和双酶切Southern杂交 ,证明外源抗性基因已经完整地整合到小麦基因组中 ;T1代植株分离比CP1+ ∶CP1-为 1∶1.3,偏离孟德尔分离定律 ;T2 代植株总RNA ,RT PCR的试验结果表明CWMV

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达姚华建李大伟于嘉林邢怡明蔡祝南刘仪（中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京１０００９４）甜菜坏死黄脉病毒（ＢｅｔＮｅｃｒｏｔｉｃＹｅｌｏｗＶｅｉｎＶｉｒｕｓ，ＢＮＹＶＶ）是一种由甜菜多粘菌（Ｐｏ...

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒 (PotatovirusS ,PVS)外壳蛋白 (CP)基因序列 (885bp)设计合成了两对引物 ,通过RT PCR扩增得到长 0 .8kb的目的片段 ,将目的片段转入大肠杆菌 ,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子 ,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较 ,发现其核苷酸同源性达 95 %左右 ;构建了含PVSCP基因的融合蛋白原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到表达 ,SDS PAGE测定融合蛋白的分子量为 5 8kD。

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白(CP)基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒(CTLV)分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714nt,推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5%～99.9%和91.1%～99.6%。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的构建

以番木瓜环斑病毒黄斑分离物(PRV—YS)RNA为模板,在人工合成的两端引物引导下,反转录合成了外壳蛋白(CP)基因cDNA第一链并通过PCR扩增获得双链cDNA。用重组有cDNA的pUC19转化E.coli DH52,采用双脱氧链终止法进行了cDNA序列分析,结果表明CP基因为861nt,与文献报道的相比,同源率90%,且少连续的6nt。

葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达

葡萄A病毒（Grapevine virus A，GVA）是葡萄病毒属（Vitivirus）的典型种，在世界葡萄产区广泛分布。采集10株‘藤稔’葡萄成熟枝条，使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现，10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT—PCR扩增，首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因（CP），该基因全长597bp。将其与GenBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树，把不同地理起源的GVA分离物分成两个变异组，其中Ⅰ组包括3个分离物（与Ⅱ组的其他分离物只有75．9％～80．1％的序列同一性）；其余的13个分离物组成Ⅱ组（组内分离物具有84．4％～99．5％的序列同一性）。构建了GVACP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株，经IPTG诱导，目的基因得到了大量表达。

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因克隆到ｐＢＶ２２０质粒上，构建成在大肠杆菌中经温度诱导表达的载体ｐＢＶＳ４。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｍ印迹结果表明，ｐＢＶＳ４在大肠杆菌ＤＨ５α中通过４２℃诱导后，特异地表达２１ｋＤ的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白。经光密度扫描估测，其表达量占大肠杆菌全蛋白的１５．２％。分离纯化经温度诱导表达的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白作为抗原，免疫家兔制备出了特异性强的ＢＮＹＶＶ抗血清。采用微量沉淀法测定其效价为１：１０２４。

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从山东省 3 地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒 6 个分离物,将其分别命名为 TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5 和 TuMV-SD6。利用 RT-PCR 克隆了这 6 个分离物的外壳蛋白基因,测定了它们的核苷酸序列,并进行了序列分析。结果表明,6 个分离物的 CP 基因均为 867 个碱基,核苷酸序列同源性较高, 达 97.0%～99.4%;它们与 World-B 组分离物的同源性最高,达 91.8%～100%;与 Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之,在 89.1%～91.0%之间;与 basal-B 组分离物的同源性最低,仅 86.0%～90.3%。基于 TuMV 的 CP 基因核苷酸序列的分子进化树显示,TuMV 分离物可分为 4 组,本研究所分离到的 6 个 TuMV 山东分离物属于第四组,即 world-B 组。用分离到的 6 个 TuMV 分离物对已获得的转 TuMV CP 基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明,尽管作为转基因的 CP 基因与这 6 个分离物的 CP 基因只有 88.2%～88.9%的同源性,但转基因大白菜对这 6 个分离物均具有明显抗性。

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及在病毒检测中的应用

根据已经发表的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白基因的序列,人工合成引物,通过反转录和PCR扩增并克隆了黄瓜花叶病毒辣椒分离物P33(CMV-P33)的外壳蛋白基因,构建到质粒PBS的Hinc位点.重组质粒经Sma酶切后,在0.8%低熔点琼脂糖上电泳,回收克隆的CP基因片段(约0.7kb),用切口平移的方法进行α-32PdATP标记.以此为探针,通过点杂交技术检测提纯的病毒CMV-P33和R1株系、CMV-P33的RNA,及受CMV侵染的辣椒叶片汁液,结果表明:提纯的CMV-P33和R1株系的最低检出量分别为1ng和4ng,CMV-P33的RNA为0.1ng.检测受CMV侵染的辣椒叶片汁液时,最大稀释倍数为100倍.其次,用该探针检测健康辣椒和受烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒侵染的烟叶汁液时,检测反应均为阴性.

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白的转基因烟草的抗病性研究

将马铃薯Ｙ病毒中国分离物（ＰＶＹ－Ｃ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因，在土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４的介导下，转化烟草生产品种ＮＣ８９，获得了６个转基因烟单株系。通过抗性分析发现，６个株系中有一个株系在２００μｇ／ｍｌＰＶＹ－Ｃ的攻毒下，仍未发病。分子检测发现，转基因植物中抗性产生的程度并不是同ＰＶＹ－Ｃ外壳蛋白的表达水平成正相关。

大豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和其在大肠杆菌中的表达

通过多聚酶连锁反应(PCR),我们合成了包括病毒外壳蛋白基因在内的病毒基因组3′端区域,并完成了其全部序列分析,比较SMV(北京分离物)和SMV-N株的序列发现:外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性达93.4%,其氨基酸序列同源性高达98.5%,就基因组3′端非编码序列而言,其同源性达88.8%。Western blot分析结果表明所克隆的cDNA片段在大肠杆菌JM107中能表达正常的病毒外壳蛋白。

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的RNA为模板,通过PCR扩增获得外壳蛋白(CP)基因的目的片段。将其重组到pGEM-7zf(+)并转化JM101得到了含有完整CP基因的重组子。采用双脱氧终止法进行序列分析,结果表明CP基因为567 nt,与文献[1]报道相比,氨基酸和核苷酸的同源性分别为98.4%和96.7%。

马铃薯卷叶病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

With designed specific primers based on Potato leafroll virus(PLRV) coat protein(CP) gene sequence,one PCR fragment(about 0.6 kb) was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) using the total RNA as template extracted from virus infected potato plant collected in Zhaotong,Yunnan province.The fragment was cloned into pGEM-T easy vector and sequenced.The sequence was compared with that of homologous gene of other PLRV isolates.The results showed it had high homology with the other isolates(the highest homology reached 99.2% of nucleic acid).Based on CP amino acid sequence the phylogenic tree of PLRV was established and the isolates were clustered into many groups.