被孢霉在可持续农业生产中的应用研究进展

被孢霉是典型的土壤腐生真菌,广泛存在于土壤及植物体内。近期大量研究结果表明,土壤中的被孢霉具有促进植物生长和帮助植物抑制病害的潜力。本文基于被孢霉的分类地位及共性特征,分别从被孢霉降解农业废弃物和有机污染物修复土壤,溶磷、产铁载体促进土壤营养元素转化,分泌植物激素和脂肪酸类物质促进植物生长,分泌拮抗物质调控根际微生物种群丰度,诱导植物自身防御反应提高植物抗病性等方面总结了被孢霉的研究与应用进展。并且对今后被孢霉在可持续农业生产中的应用前景进行了展望,以期为研制安全、稳定、高效的农业生产中微生物菌剂提供方向,为优化植物促生及抑病策略奠定基础。

高山被孢霉NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶的异源表达与活性分析

产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。为了深入研究MaIDH4的性质,该文将其在大肠杆菌和毕赤酵母系统中分别进行异源表达并纯化,均成功获得纯酶,并考察了不同表达系统对酶活性和产量的影响。首先克隆MaIDH4至表达载体pET28a(+)和pPink-HC-3CZHEK构建重组质粒,然后分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)和PichiaPink TM Strain 2进行诱导表达,最后采用镍柱纯化获得携带10×His标签的MaIDH4重组酶,检测纯酶的比活力分别是34.10 U/mg和43.00 U/mg,酶产量分别为10.28 U/L和159.12 U/L。通过纯酶比活力和酶产量分析表明相比于大肠杆菌表达系统,毕赤酵母宿主更适合MaIDH4的异源表达。

高山被孢霉低温应激条件下油脂代谢研究

对高山被孢霉在不同温度下的生物量、油脂产量和油脂组成等指标进行研究,并开展了比较代谢组学研究。结果表明:在低温处理(15℃)时,高山被孢霉的生物量和油脂含量均低于常温(25℃)处理。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量提高到了2.53倍,而且极性脂中的不饱和脂肪酸含量提高到了1.32倍,表明高山被孢霉的低温保护机制启动,大量合成极性脂和不饱和脂肪酸用于抵御低温应激。差异化合物筛选发现其中与油脂合成和降解有关的有10个化合物,与糖酵解(EMP)途径有关的有6个化合物,与氨基酸合成、降解和转运相关的化合物有5个。

高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件优化

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵母膏12.0 g/L、KH_(2)PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H_(2)O 0.5 g/L、装液量200 mL/L、发酵时间7 d、发酵温度25℃、初始pH 6.5。在此优化条件下,高山被孢霉发酵后生物量及油脂产量分别达到26.23 g/L和8.98 g/L。经GC分析高山被孢霉产油脂组成为软脂酸(C_(16:0))、硬脂酸(C_(18:0))、油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2))、十八碳三烯酸(C_(18:3))、花生三烯酸(C_(20:3))、花生四烯酸(C_(20:4))、二十二烷酸(C_(22:0)),其中不饱和脂肪酸C_(18:1)、C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4)的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%,其总含量超过69.00%,多不饱和脂肪酸(C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4))的总含量超过52.00%。

被孢霉对土壤养分有效性和秸秆降解的影响

腐生真菌被孢霉在富含有机质的土壤中丰度很高,为土壤碳及养分转化的关键微生物成员。然而目前关于土著被孢霉在秸秆分解过程中对土壤养分有效性影响的研究较少。采用常规平板稀释法从长期施用有机肥的红壤和砂姜黑土中分离真菌菌株,将分离得到的菌株序列与基因库(GenBank)中的序列进行比较,鉴定出了两株被孢霉菌株,即高山被孢霉(Mortierella alpina)和长孢被孢霉(Mortierella elongata)。通过设置盆栽试验,每盆土接种10 g菌剂,研究两株被孢霉对秸秆降解过程中土壤养分有效性和细菌群落的影响。结果表明,在红壤中,与未接种对照相比,接种高山被孢霉处理的土壤有效磷含量提高了29.0%,长孢被孢霉处理下土壤有效氮含量和β-葡萄糖苷酶活性分别提高了15.5%和81.3%。在砂姜黑土中,与对照相比,被孢霉菌株显著提高了土壤可溶性有机碳,速效氮和有效磷的含量以及β-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性。两株被孢霉在红壤中抑制了秸秆的降解,并显著改变细菌群落组成。而在砂姜黑土中,被孢霉菌株促进了秸秆降解,且对细菌群落结构影响不大。在红壤中,苍白杆菌属(Ochrobactrum)、无色杆菌属(Achromobacter)和链霉菌属(Streptomyces)是导致接种处理和对照之间细菌群落差异贡献最大的类群。本研究为土著被孢霉在农业土壤中秸秆分解和养分转化中的作用提供了理论依据。

深黄被孢霉高产脂变株的选育及其发酵的研究

以深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）AS3．3410为出发菌株，经紫外线，硫酸二乙酯和亚硝基胍复合诱变处理，选育成功高产脂深黄被抱霉M018变株，其摇瓶培养菌体油脂含量达65．6％，比出发菌株提高133％。60m3罐三级发酵培养菌体油脂含量高达79．2％，生物量达37．8g／L．气相色谱分析表明变株M018r-亚麻酸的含量比出发菌株提高了53％。连续传代试验表明M018是一稳定的变株。该变株油脂合成的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母膏，最佳C／N为60：1，中温（25～30℃）适于菌丝生长，低温（15～20℃）适于细胞油脂合成。代谢曲线表明M018变株是在培养基残氮极低时，才开始将葡萄糖大量转化合成油脂。

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

深黄被孢霉生物转化十六醇合成油脂的研究

Mortierella isabellina was found to accumulate lipid with 2% hexadecanol and 1% yeast extract as the growth substrates. The amount of lipid reached 64.5% of dry mycelia, and unsaturated acids accounted for 97.05% of the total fatty acids. Mean while, 75% of hexadecanol in medium was converted to lipid. The biosynthetic route from hexadecanol to linoleic acid was presumed as follows: HexadecanolC18∶0（Steric acid）C18∶1（Oleic acid）C18∶2（Linoleic

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍（MNNG）诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1-2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

提高深黄被孢霉菌丝细胞油脂合成总量及其不饱和脂肪酸酯含量的研究

葡萄糖的添加方式对深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌａｉｓａｂｅｌｉｎａ）Ｍ０１８菌株细胞油脂的生物合成影响显著，葡萄糖流加（３０ｈ）培养所得菌体细胞油脂含量达８０．５％，比消前一次性加入培养所得菌体细胞油脂含量提高了１７．２％。Ｚｎ２＋可显著提高油脂的碘值，但对细胞油脂合成总量影响甚微。柠檬酸钠有利于菌丝细胞生长，但不利于油脂的生物合成。培养温度在２０～２５℃之间适合菌丝细胞的生长，也有利于细胞合成油脂，低温有利于不饱和脂肪酸酯的合成。Ｍ０１８菌株将葡萄糖转化合成油脂的同时，菌丝细胞形态发生显著改变，丝状细胞逐渐膨大呈球形或椭圆形。以乙醇和正已烷对菌体进行分步抽提，油脂得率最高。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ 亚麻酸 (GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸 ,在大多数油料作物种子中不含有GLA ,而只含有其前体物亚油酸 ,只有少数油料植物种子中含有GLA ,如夜来香 (Oenotheraspp) ,琉璃苣(Boragoofficinalis)等。Δ6 脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA ,我们将从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,与植物表达载体pGA6 43连接 ,构建了重组质粒pGAMICL6 ,将其通过农杆菌介导法 ,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中 ,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析 ,结果显示 ,GLA和十八碳四烯酸 (OTA)分别占总脂肪酸含量的 19 7%和 3 5 %。

被孢霉生物合成花生四烯酸的初步研究

花生四烯酸不仅是细胞膜的重要成分，在维持细胞膜的结构与功能上发挥重要作用，而且是人体前列腺素合成的前体物质，对人体生理功能具有重要的调节作用。近年来研究发现，花生四烯酸在保护皮肤、降低胆固醇、抑制血小板聚集、提高免疫能力、促进胎儿发育等方面具有独特的...

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱 质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

高山被孢霉产花生四烯酸发酵条件的研究

通过一株高山被孢霉M_(20)(Mortierella alpina)产花生四烯酸的摇瓶发酵研究,确定了其最佳发酵培养基组成及最适摇瓶发酵工艺条件。摇瓶实验确定的最佳培养基组成为(g/L):玉米粉水解液葡萄糖150,酵母粉15,KH_2PO_4 3.0,NaNO_3 3.0,MgSO_4·7H_2O 0.5。最佳发酵工艺条件为:初始pH6.5,装液量为50ml/500ml摇瓶,摇床转速150r/min,温度在菌体生长前三天控制在25℃培养,以后调至20℃培养。在此条件下,发酵培养被孢霉的生物量、菌体总油脂及花生四烯酸分别高达35.5g/L、13.2g/L及2.2g/L,在15L及1000L自动机械搅拌罐进行发酵试验,AA产量分别高达1.86g/L及1.70g/L。

YAG激光照射对高山被孢霉花生四烯酸产量的影响

花生四烯酸产生菌高山被孢霉的孢子在时间为 8m in,距离为 10 cm的 YAG激光剂量照射下 ,其致死率为 75 %～ 80 %。以该剂量反复进行照射及菌种筛选 ,得到其最高生物量 2 8. 6 g/L,油脂 11. 0 4 g/L,AA3. 10 g/L 的突变株 T1 0 5,比对照菌株的 AA产量及油脂量分别提高了 2 . 95倍和 1. 71倍。通过对突变株 T1 0 5的形态、代谢情况以及继代稳定性进行分析 ,认为 YAG激光诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法。

被孢霉菌发酵产生花生四烯酸的研究

研究了温度、培养基初始pH、碳源、氮源对被孢霉(Mortierella sp.)产生花生四烯酸的影响。正交试验结果表明,Mortierella sp.M10最佳培养基组成为(g/L):葡萄糖100,酵母膏10,KNO_3 4.0,KH_2PO_4 2.0,CaCl_2·2H_2O 0.1,MgSO_4·7H_2O 0.5,FeCl_3·6H_2O0.015,ZnSO_4·7H_2O 0.0075,CuSO_4·5H_2O 0.0005。采用最佳培养基及发酵条件,细胞干重和花生四烯酸产量分别为33.51g/L和0.827g/L。同时对摇瓶发酵过程进行了分析。

夹带剂对超临界CO_2萃取被孢霉中γ-亚麻酸油脂的影响

几种不同的夹带剂加入超临界ＣＯ２中，对油脂萃取量及油脂中γ－亚麻酸含量均有较显著的影响；选择适合的夹带剂可以降低油脂萃取所需的ＣＯ２密度和操作压力。