恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 。

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株的ＭＳＡ２基因，测定并分析了全基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株ＭＳＡ２基因序列完全相同，全长为７９５ｂｐ，编码２６４个氨基酸，与ＦＣＱ－２７／ＰＮＧ株ＭＳＡ２高度同源。对抗原表位进行多参数综合分析表明，我国虫株除具有国外已确定的抗原表位ＳＴＮＳ、ＤＴＰＴＡＴＥ外，在第５３—７２位氢基酸间可能具有一个新的抗原表位。

恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫海南分离株 (FCC- 1/ HN)裂殖子表面抗原 2 (MSA2 )基因片段的重组真核表达质粒p BK/ MSA2。 方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒 p BCG/ MSA2中分离出经过测序鉴定的 MSA2基因片段 ,将其亚克隆入真核表达载体 p BK- CMV,构建重组真核表达质粒 p BK/ MSA2。经 IPTG诱导 ,重组质粒在大肠杆菌 DH5 α中进行表达 ,并进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)及免疫印迹 (Western- blot)分析。 结果 从 p BCG/ MSA2中分离出 MSA2基因片段 ,成功构建 p BK/ MSA2重组质粒 ;SDS- PAGE及 Western- blot分析结果显示 ,特异性蛋白条带的分子质量约为 31ku。 结论 恶性疟原虫

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的 构建恶性疟原虫 FCC- 1/ HN株 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重组子 p BCG5 .6 / MSA2 ,并进行序列测定。 方法 根据恶性疟原虫 MSA2编码基因的两侧序列设计引物 ,采用 PCR技术扩增出 MSA2编码基因全长片段 ,经低熔点琼脂糖挖块法回收纯化后 ,插入分枝杆菌穿梭质粒 p BCG5 .6 / MSA2 ,并转化大肠杆菌 DH5 α,快速酚法初筛阳性重组子 ,阳性克隆以 PCR法与限制性酶切分析鉴定后 ,双脱氧链终止法双向进行序列测定。 结果 从恶性疟原虫基因组中扩增出约 82 0 bp的基因片段 ,所构建 p BCG5 .6 / MSA2重组体阳性克隆经双酶切和 PCR鉴定与预期结果一致 ,测序结果确证了插入片段的正确性。 结论 成功构建了恶性疟原虫 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒 ,为恶性疟 BCG疫苗的研制奠定了基础。

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和表面蛋白-2(MSP-2)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG/MSP-1和pBCG/MSP-1-2多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠,经多价疫苗免疫8周后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾细胞,用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化,体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比,疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞有显著性增高,体外培养的脾细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应,抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1/HNpBCG/MSP-1和pBCG/MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。

恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2基因在M.smegmatis mc^2155中的表达

目的 研究裂殖子表面抗原 2 (merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )基因重组BCG疫苗的保护作用。方法 采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG/MSA2导入耻垢分枝杆菌 (M .smegmatis)mc2 1 55中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组M .smegmatismc2 1 55培养于middlebrook 7H9broth (M7H9)培养基 ,并添加 1 0 %M7H9enrichmentADC和 0 .0 5%Tween80 ,4 8～ 72h后于 4 5℃进行 3 0min的诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)及Westernblot分析。结果 SDS PAGE及Westernblot分析结果均显示在相对分子质量 (Mr)约 3 1× 1 0 3的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的Mr 相符。结论 恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在M .smegmatis中表达 。